白酒中甜味剂检测的方法探讨与应用

徐祥，徐建彬，梁斌，徐俊

河南省白酒质量监督检验中心（信阳 464400）

白酒是我国特有的民族传统产品，有着上千年的历史，与伏特加、白兰地、朗姆酒、威士忌、金酒并列为世界六大蒸馏酒[1]。中国白酒主要是以粮谷为主要原料，用大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的[2]。白酒中除乙醇和水以外，还含有1%左右的有机物，如有机酸（醋酸，乳酸，苹果酸，酒石酸和亚油酸等）、酯类（乙酸乙酯，乳酸乙酯和己酸乙酯等）、内酯、酚类、醇类、杂环、萜烯和芳香族化合物等。这些有机物对白酒的风味起到及其重要的作用[3]。

甜味剂是一类重要的赋予食品以甜味，可提高食品品质的食品添加剂。在现代食品工业中广泛应用的甜味剂主要包括乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）、邻苯甲酰磺酰胺钠（糖精钠）、环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）、三氯蔗糖（蔗糖素）等[4-6]。研究发现，摄入高剂量的甜味剂会对人体的肝脏和神经系统造成伤害，甚至引发癌症。因此，甜味剂在生产中合理的使用，不仅关系到产品的品质，更关系到消费者的安全与健康[7]。针对白酒来说，一些生产企业在白酒生产过程中从自身利益出发，为掩盖白酒的苦涩和保持酒体干冽、醇厚、绵软的口感，违法添加甜味剂如安赛蜜、糖精钠等来改善白酒的口感。也有企业因原材料进货把关不严，使用含有甜味剂的酒用香精香料，造成白酒产品中甜味剂超标。但GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[8]中明确规定，白酒在生产过程中不允许添加人工甜味剂。

目前关于食品中甜味剂的检测方法较多，如高效液相色谱-紫外检测法[9-13]、超高压液相色谱-蒸发光散射检测法[14-15]、液相色谱-质谱联用检测甜味剂的报道[16-18]。液相色谱-质谱/质谱法虽是检测白酒中甜味剂的最佳方法，但其设备比较昂贵，难以普及，应用范围受限。试验结合国家标准中安赛蜜、糖精钠的测定方法[19-20]，优化白酒中安赛蜜、糖精钠的样品前处理步骤，探索各因素对试验结果的影响。该试验方法操作简单，对基层检测机构和白酒企业中安赛蜜、糖精钠的日常检测具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

有机滤膜（孔径0.22 μm，津隆）；水（娃哈哈纯净水）；甲醇、乙酸铵[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；食品甜味剂乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）溶液标准物质[1.00 mg·mL-1，GBW（E）100171]、食品甜味剂糖精钠溶液标准物质[1.00 mg·mL-1，GBW（E）100166）：北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司。

乙酸铵溶液（20 mmol·L-1）：称取1.54 g乙酸铵，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL，经0.22 μm水相微孔滤膜过滤后备用。

白酒样品由河南五谷春酒业股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Agilent1260高效液相色谱仪（配有紫外检测器、自动进样器、OpenLabChemStation工作站，安捷伦科技有限公司）；1 000 mL全玻璃微孔过滤器（津隆）；ML204电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm。柱温：40 ℃；流动相：甲醇-乙酸铵溶液=20∶80（V/V）；流速：1 mL·min-1；检测波长：230 nm；进样体积：10 μL。

1.3.2 标准曲线

分别准确移取安赛蜜、糖精钠标准储备液，用纯净水稀释成1，5，10，20和30 μg·mL-1标准系列质量浓度。在最佳的色谱条件下，分别取10 μL进行色谱分析，以标准系列溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品测定

样品前处理：准确量取25 mL酒样于50 mL玻璃烧杯中，水浴加热至酒样近干，用娃哈哈纯净水定容至25 mL，过0.22 μm有机滤膜，待上机分析。

2 结果与分析

2.1 液相条件的优化2.1.1 柱温的影响

通过多次试验，详细考察了不同柱温对安赛蜜和糖精钠的保留时间、样品峰的对称性及样品的响应值等影响。将柱温分别设定10，20，30，40和50 ℃进行试验，如图1所示。温度较低时，糖精钠的色谱峰较宽，响应值较低。随着温度的升高，安赛蜜和糖精钠保留时间逐渐缩短，样品峰的对称性逐渐增高，样品的响应值逐渐增强。但是考虑到温度过高，对色谱柱的使用寿命有重大影响，所以将柱温的优化温度选择为40 ℃。

图1 不同柱温条件下安赛蜜和糖精钠的色谱图

2.1.2 流动相的影响

试验以GB 5009.28—2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》和GB/T 5009.140—2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》为依据。由于GB/T 5009.140—2003中流动相配制过程繁琐，且乙腈毒性相对较大，对操作者有潜在的危害，所以选择GB 5009.28—2016中流动相（甲醇-乙酸铵溶）液。如图2所示，甲醇与乙酸铵溶液比例少量变化就会对安赛蜜与糖精钠的保留时间有较大影响。随着甲醇比例的增加，安赛蜜与糖精钠的保留时间逐渐缩短，样品的响应值逐渐增强。但是当甲醇比例超过20%时，样品保留时间缩短变化不明显，且两峰距离较近，不利于准确定量。综合灵敏度和分离度等因素考虑，将流动相甲醇与乙酸铵溶液比例设置为20∶80（V/V）。

图2 流动相甲醇与乙酸铵溶液不同比例条件下安赛蜜和糖精钠的色谱图

2.2 样品前处理条件的选择

由于白酒中乙醇质量分数较高，在进行液相色谱分离时，容易对甜味剂在色谱柱的保留性能产生影响[21]。通过图3中（a）与（b）对比发现，样品未经前处理直接进样后，谱图较复杂，对糖精钠的响应吸收有重要影响，且样品中的某种物质与安赛蜜的色谱峰有部分重叠，影响安赛蜜的准确定量。因此，样品必须经过前处理，减少乙醇等其他物质的影响。样品在GB/T 5009.140—2003中经过前处理约稀释了10倍，在GB 5009.28—2016中约稀释了25倍。用稀释的办法确实可以解决酒样基质效应问题，减少乙醇等其他物质的影响。但因方法的定量限较高，不符合实际样品的检测，因此稀释方法不适合所有白酒中痕量甜味剂的检测[18]。试验采用水浴加热的方法降低白酒中乙醇等其他物质的含量，减小其对色谱峰的影响，减弱基质效应。通过图3（c）与（d）对比发现，通过水浴加热的方式进行前处理，样品的色谱峰与安赛蜜和糖精钠标准溶液混合液的色谱峰的保留时间，响应值基本保持一致，排除了乙醇等物质的影响。

图3 色谱图

2.3 线性范围和检出限

配制安赛蜜、糖精钠质量浓度范围在1～30 μg·mL-1的系列标样溶液，按试验确定的最佳色谱条件下进行测定，获得不同质量浓度下各组分的峰面积。将组分峰面积相对应的质量浓度绘制工作曲线，各组分的线性方程、线性范围、相关系数如表1所示。样品中甜味剂的定量范围为1～30 μg·mL-1，相关系数r＞0.999 9，可以满足日常检测的要求。在记录的色谱图中，以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）分别计算对应目标化合物的质量分数，得出目标化合物的检出限和定量限。安赛蜜的检出限为0.15 mg·kg-1，定量限为0.35 mg·kg-1；糖精钠的检出限为0.75 mg·kg-1，定量限为1.7 mg·kg-1，远低于国标方法的规定。

表1 两种甜味剂的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

试验采用空白基质添加不同浓度的目标化合物的混合标准溶液，在已优化的色谱条件下，对目标化合物进行定量。分别移取质量浓度为1.00 mg·mL-1的安赛蜜、糖精钠标准储备液，制成质量浓度为2，4和20 μg·mL-1的加标溶液，按1.5小节进行样品处理，按照最佳优化条件下进行色谱分析，平行测定6次，具体情况见表2。由表2可以看出，安赛蜜的加标回收率在92.81%～100.58%之间，相对标准偏差在1.23%～4.46%之间；糖精钠的加标回收率在95.34%～101.93%之间，相对标准偏差在2.41%～6.64%之间，测定结果准确可靠。

表2 两种甜味剂的相对标准偏差和回收率

2.5 样品检测结果

在上述建立的色谱条件基础上，对河南五谷春酒业股份有限公司提供的酒样1#，2#，3#，4#，5#和6#进行色谱检测，测定结果如表3所示。所检测酒样中均未检出安赛蜜、糖精钠，所测结果符合国家标准对蒸馏酒中甜味剂含量的要求。

表3 酒样中两种甜味剂的测定结果

3 结论

通过以上试验，建立了一种采用高效液相色谱同时检测白酒中安赛蜜与糖精钠两种甜味剂的方法。该方法快速、高效、准确，能够在3 min内完成样品的分析，大大节省了单次单个检测耗费的试剂和时间，提高了工作效率。白酒样品只需进行水浴加热后定容，即可进样检测，弥补了国家标准方法的前处理复杂，不适合所有白酒中痕量甜味剂的检测不足之处，对保护白酒生产企业和消费者的利益起到了很大的作用。该方法的精密度和精确性均较好，可望在基层检测机构的市场监测过程中发挥重要的作用。