复合菌群利用模拟APG协同FNA预处理剩余污泥水解液合成PHA

王娜，宋秀兰，昝博韬

（1 太原理工大学环境科学与工程学院，山西 太原 030024；2 University of Washington,Seattle,USA）

聚羟基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一种典型的由微生物直接合成的可降解生物塑料。PHA 主要有两种类型：聚羟基丁酸酯（PHB）和聚羟基戊酸酯（PHV）。它可以由产PHA菌群以短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）为碳源合成，当细菌的生长过程中缺乏必需的氮、磷、微量元素或受重金属的胁迫时，其可以作为细菌体内的碳源和能源储存物质被重新利用。PHA具有传统塑料所没有的生物降解性、生物相容性等，用它替代石化塑料可以使二氧化碳排放量最小化和减少塑料在自然环境中的积累，进而减轻对环境的污染。

活性污泥厌氧发酵产生的短链脂肪酸既可作为廉价碳源用于PHA生产，也可以作为废水生物脱氮除磷处理中微生物的必要碳源。游离亚硝酸（free nitrous acid，FNA）是一种可再生、低成本的厌氧消化液硝化产物， 烷基糖苷（alkyl polyglucose，APG）是一种易降解的对环境友好的生物表面活性剂，这两种物质均可有效地促进污泥的溶解和水解，提高污泥产酸。杨黎俊采用FNA预处理协同APG处理剩余污泥，在温度30℃、FNA 预处理2 天后加入APG、初始发酵pH=7.00、APG 投 加 量 为0.075gAPG/gVSS、 FNA 浓 度 为0.653mg/L、发酵5天条件下，SCFAs产量最大，为(324.94±1.98)mgCOD/gVSS，表明通过FNA 预处理协同APG 处理剩余污泥能够强化产酸，可以低成本地提供碳源用于PHA 的合成。不同的处理污泥方式导致水解液中SCFAs 组成变化，进而影响PHA的合成量。

本文根据杨黎俊FNA预处理协同APG处理剩余污泥的最佳产酸条件下水解液SCFAs组成，启动两种不同接种污泥的序批式反应器（SBR）富集PHA 产生菌，研究活性污泥复合菌群以模拟FNA预处理协同APG 处理剩余污泥水解液为底物PHA合成效果，并采用批次合成实验，考察pH、C/N和C/P 对PHA 合成量的影响，探究实际的FNA 预处理协同APG 处理剩余污泥水解液为底物时PHA合成效果。

1 材料和方法

1.1 PHA产生菌富集装置

采用有效容积为2L 的SBR 反应器，按照传统的好氧及底物充盈/匮乏（feast/famine，也称ADF模式）交替环境下富集PHA 产生菌。SBR 配有搅拌、曝气、进出水恒流泵以及在线pH、溶解氧（DO）监测系统。SBR 的运行周期为12h（进水10min、反应555min、沉淀90min、排水10min）；水力停留时间HRT=1 天；污泥停留时间SRT=10天。试验装置如图1所示。反应阶段同时进行曝气和搅拌，空气流速60～80L/h，搅拌采用机械搅拌，搅拌转速为120r/min。

图1 试验装置图

1.2 PHA产生菌富集的污泥来源和接种驯化

采用序批式SBR 反应器富集PHA 产生菌，启动了两组接种不同接种污泥的SBR 反应器。SBR1接种太原市豪峰污水处理厂二沉池污泥，接种污泥浓度为5120mg/L；SBR2接种以葡萄糖为底物驯化成熟的产PHA混合菌，接种污泥浓度为3650mg/L。因实际污泥水解液含有SCFAs、多糖、溶解性蛋白质、氨氮和磷酸根等，成分复杂，对富集PHA 产生菌不利，且实验室设备难以稳定供给富集阶段所需大量水解液；所以试验采用人工配水，以乙酸钠、丙酸钠、丁酸、戊酸为碳源，氯化铵为氮源，磷酸二氢钾为磷源。乙酸钠、丙酸钠、丁酸、戊酸的比例根据杨黎俊采用APG协同FNA预处理剩余污泥最佳产酸条件下的水解液SCFAs组成确定，见表1。以模拟FNA预处理协同APG处理剩余污泥所得水解液为底物，控制化学需氧量COD=1200mg/L，C∶N∶P=100∶6∶1（质量比，下同），碳源和氮源成分组成如表2所示。另外加微量元素营养液0.5mL/L，其配料表如表3 所示。添加0.04g/L 硫脲抑制硝化作用。

表1 FNA预处理协同APG处理剩余污泥水解液SCFAs成分

表2 碳源、氮源组成

表3 微量元素营养液配料表

1.3 实验方法

SBR 的取样周期为5～7 天，取样时间贯穿整个曝气反应期。周期开始时测定反应器污泥浓度，随后取样按照“先密后疏”的方法进行取样，并在线监测DO，开始阶段每隔5～10min取样，DO突跃点之后可适当延长，取样间隔时间可逐渐从30～50min延长至90～100min。

PHA 合成批次试验是以SBR 反应器排泥为种泥，以模拟FNA 预处理协同APG 处理剩余污泥的水解液为底物。实验前对种泥进行1h 的预曝气，确保剩余污泥中的氨氮等营养物质被耗尽，以免对试验干扰。PHA 合成实验在500mL 烧杯中完成，采用批次补料方式。每批次添加200mL 底物（只含碳源，不含氮磷源），底物浓度为2400mgCOD/L，曝气反应时间为1.5h，结束后停止曝气，静沉，排除200mL 上清液之后进入下一批次实验。如此循环5 个周期，实验过程在线监测DO，每一批次的开始及结束均要及时取样，在反应开始以及最后一个批次结束后各取样测一次污泥浓度。

1.4 实际污泥水解液中氮、磷去除及PHA合成

试验所用污泥来自太原市杨家堡污水处理厂二沉池污泥，污泥取回在4℃的冰箱中沉淀浓缩24h，配成12g/L的污泥。采用6个500mL血清瓶，每个添加450mL污泥，加入FNA浓度0.653mg/L，预处理2天，预处理过程调节pH 保持为6；预处理后投加APG，投加量为0.075gAPG/gVSS，调节pH为7，所有血清瓶用氮气吹扫5min后，立刻用橡皮塞密封，放置在温度为(30±1)℃的恒温空气摇床中进行厌氧发酵。发酵5天，离心分离后获得实际污泥水解液。

实际的FNA 协同APG 处理剩余污泥水解液中除含有SCFAs、蛋白质、糖类等有机组分外，还含有氨氮和磷酸根，会影响PHA 合成，因此向实际污泥水解液中投加镁盐去除其中氮和磷。在温度25℃、pH 为11.0、Mg/P 为2.6/1mol/mol、=10min条件下，进行脱氮除磷处理，然后经离心分离后，上清液用于进行PHA 合成批次试验，实验方法同1.3节，上清液性质见表4。

表4 鸟粪石沉淀法去除氮磷后的水解液的基本性质

1.5 分析项目和方法

2 结果和分析

2.1 富集反应器运行工况监测

SBR 富集反应器作为整个三段式PHA 合成工艺的核心装置，对其运行稳定性的要求是最基本也是最重要的，富集反应器的运行稳定性主要通过其中活性污泥的物理性状来表现。以SVI、MLSS 作为反应器稳定运行工况控制指标综合评价富集体系的运行稳定性，SBR1、SBR2 富集反应器运行结果如图2所示。

图2 SBR富集反应器启动期污泥稳定性相关参数变化

由图2 可以发现，SBR1 在启动初期SVI 一直处于200mL/g左右，有轻微的污泥膨胀现象。由于前期为了抑制污泥膨胀加NaCl 导致第11～15 天污泥浓度突然升高，停止加药后污泥浓度逐渐开始下降，经过60 天的培养逐渐达到稳定，污泥浓度保持2.5g/L。污泥沉降性SVI在驯化过程中反复波动，活性污泥膨胀严重，SVI 值最高达到397mL/g，经镜检排除丝状菌膨胀。通过改善系统曝气均匀性，污泥沉降性能好转，最终SVI 值稳定在130mL/g。SBR2反应器接种污泥为以葡萄糖为底物富集的驯化污泥，更换碳源后污泥的沉降性变差，SVI值很长时间内维持在200mL/g。经过100 天的驯化，污泥浓度维持在2～3g/L，SVI 维持在120mL/g 以下。SBR2的污泥浓度和SVI波动相对SBR1更加平稳。

2.2 富集反应器富集效率评估

2.2.1 富集反应器周期内PHA合成效率

观察了每组反应器在富集第30 天、第60 天和第117天时周期内的DO、PHA、COD、SCFAs等参数变化情况，并依据所测得的相关参数计算PHA转化率以及PHA比合成速率，其结果见图3。

图3 SBR富集反应器周期内最大PHA合成量

图3 为不同SBR 富集反应器不同阶段突跃点PHA 合成量，即为富集阶段沿程取样过程中PHA产量最高的点。由图3中可知，随着富集时间的推移，两组SBR的富集效果都在不断提升，SBR1中PHA 产量由30 天的5.95%上升至117 天的12.93%，SBR2中PHA产量由30天的6.88%上升至117天的11.48%。相对于SBR1，SBR2 富集阶段沿程取样中30～60天PHA产量较高，但随着富集时间的推移SBR1的最大PHA 含量逐渐增大，直至第117天时相比SBR2高1.45%。

2.2.2 富集反应器污泥批次实验PHA合成效率

在对富集反应器进行周期内PHA 合成效率研究的同时，对2组反应器周期内排出的污泥在限制营养的条件下进行了PHA 合成的批次实验，通过考察批次实验中的最大PHA 积累量、PHA 比合成速率、PHA 转化率，考察富集阶段的污泥应用于PHA 生产阶段时其实际PHA 合成能力高低，结果见图4及表5所示。由2.2.1节可知在周期沿程取样中两个反应器最大PHA 合成量（突跃点）都随富集时间的推移而增大，但在使用SBR 反应器排泥进行批次合成实验时，SBR2的PHA累积合成含量变化趋势反而出现了随时间下降的现象。这可能是由于驯化污泥在SBR 反应器中富集时间过长，导致有一定的老化污泥沉积，导致活性降低，进而影响后续批次合成中PHA 合成潜力。SBR1 的PHA累积合成含量出现先下降后上升的趋势，先由36.77%（30 天）降至28.87%（60 天），这是由于第60 天时，SBR1 在第60 天突然出现了污泥膨胀现象，SVI 高达330mL/g，对反应体系中的微生物有一定冲击，进而导致PHA 合成菌的合成能力降低，之后反应器污泥通过自我恢复沉降性能好转，所以富集117天时SBR反应器排泥进行批次合成试验的合成潜力升高，PHA 累积合成含量达到51.66%。与表5 中研究成果对比，这个产量与污泥碱性厌氧消化液做碳源合成PHA产量较接近。但是FNA 协同APG 处理污泥获得碳源方法较污泥碱性厌氧消化成本低，不需要防腐蚀。SBR2在第30 天时PHA 累积合成含量最高，可以得出，短时间内，接种驯化污泥比接种回流污泥能够更好富集PHA 合成菌。以上结果表明以二沉池污泥为种泥进行一段时间的培养富集可实现较大的合成批次PHA 产量，以葡萄糖为底物驯化成熟的产PHA 混合菌作为种泥可在短期内使微生物适应新环境，完成PHA 合成菌的富集，达到较高的批次合成PHA产量，但在漫长的富集中，可能会出现污泥性能恶化，导致PHA 合成效率稍有降低。因此后续的PHA合成工艺的控制条件优化采用SBR1富集反应器污泥为研究对象。

图4 富集期SBR富集反应器批次实验中PHA累积合成量

表5 文献中的PHA合成量汇总

2.3 PHA合成工艺的控制条件优化

以SBR1富集反应器期试验结束后排出的污泥为批次试验菌种，以模拟FNA预处理协同APG处理剩余污泥的水解液为底物，探索pH、C/P和C/N对PHA合成的影响，以确定最优的pH、C/P和C/N。

2.3.1 pH对PHA合成的影响

不同pH 下，使用模拟碳源进行批次合成试验研究结果如图5 所示。在前两个批次中，pH=6 时的PHA累积合成量大于其余两个pH时的，而在第三个批次开始，PHA 合成量明显低于其余条件，这可能是由于经过两次进料反应后，反应体系中酸度积累，抑制了PHA 合成菌的活性，进而引起微生物摄取有机物的速率降低，导致微生物合成PHA的含量降低，仅为45.31%。pH=8时的合成效果比pH=7 时好，最终PHA 累积合成量为51.14%，比pH=6 时高出6%左右。一些文献研究了pH 对PHA生产过程的速率和效率的影响。有研究发现，当酸碱度控制在8.0～9.0 时，可以观察到较高的PHA 生产率；有的研究表明在酸碱度为6.90时，有利于生产PHA。在本试验中，对PHA 合成的最佳pH为8。蔡萌萌也发现在弱碱性条件下有助于提高PHA 产量。本文结论与蔡萌萌的研究结果一致。在不同pH条件下，PHB与PHV的组分占比并未有太大变化，PHB/PHV 都为1.14 左右。模拟APG 协同FNA 预处理剩余污泥的水解液中乙酸、丁酸比例和为61.32%，丙酸、戊酸比例和为38.68%。乙酸、丁酸有利于PHB 合成，丙酸、戊酸有利于PHV 合成。模拟APG 协同FNA 预处理剩余污泥水解液SCFAs 组成对PHB/PHV 比例有一定影响。

图5 不同pH下合成批次试验的PHA累积合成量情况

2.3.2 碳磷比对PHA合成的影响

在pH=8 的基础上，考察反应器在C/P 为100∶0.03、100∶0.5 和100∶1 时PHA 积累情况，结果见图6。在限磷条件下，PHA产量有一定提高，在C/P=100∶1 时，PHA 为38.77%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的60%。在C/P=100∶0.5 时，PHA的含量较C/P=100 时有显著提高，PHA 合成量为48.46%。进一步限制磷浓度使C/P 达到100∶0.03时，PHA 为53.25%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的52.23%。总体来说，随着进水底物中磷浓度的减少，批次合成试验的PHA 含量升高。许多研究表明较低的磷浓度会促进聚羟基烷酸酯的最大积累，这与本试验研究结果一致。此外可以观察到，随着C/P 的增大，PHB/PHV 减小，即PHV 含量随着磷的增加有显著降低，PHB 含量降低不明显，这表明限磷过程对污泥合成PHV 的影响较PHB影响更大。

图6 不同C/P下合成批次试验的PHA累积合成量情况

2.3.3 碳氮比对PHA合成的影响

在pH=8、C/P=100∶0.03的基础上，考察反应器在C/N为100、125和150时PHA积累情况，结果见图7。在C/N 为100 时，PHA 含量为38.84%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的53.9%。进一步限制氮浓度使C/N 达到125 时，PHA 产量显著提高，PHA 含量为57.34%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的56.26%。而当进一步将氮浓度减少到C/N为150 时，PHA 的含量反而降低。一些研究表明，C/N=125时能够获得最大PHA合成量，本试验研究结果与他们的结果吻合。同时，图8 中可以观察到C/N=100∶1 时，随着批次的进行，每个批次进料的底物消耗量逐渐减少，导致底物也逐渐积累，最后一个批次中，对底物的消耗量低于其余两种条件，甚至不足C∶N=150∶1条件下的一半。C/N=100时，反应体系内挥发酸在每次进料后消耗量都较少而导致挥发酸积累过多，进而引起底物抑制作用，引起微生物摄取有机物的速率降低，导致微生物PHA 合成率降低。过低的碳氮比会导致较低的碳源消耗速率和提高细胞生长速率，随之导致了PHA 的合成速率降低。氨氮作为细胞生长的限制性因素，碳氮比升高，氮源含量相对减少，会降低细胞生长速率，提高PHA 合成菌的合成速率，从而提高PHA 的产量。综上所述，在本次试验中可以得出PHA 合成批次试验的最佳条件为：pH=8，C∶P=100∶0.03，C∶N=125。

图7 不同C/N下合成批次试验的PHA累积合成情况

图8 不同C/N下合成批次试验的底物消耗情况

2.4 实际污泥水解液合成PHA

将去除氮、磷的实际水解液进行PHA 的批次合成实验，结果如图9所示。由图9可知，随着批次进料的推移，PHA累积合成量呈现上升的趋势，由反应开始的2.64%升至最后一次补料结束后的24.43%，PHB与PHV含量分别为16.62%和7.82%。

图9 实际污泥水解液合成批次试验中PHA含量的变化规律

实际污泥水解液做底物时PHA 累积合成量与模拟污泥水解液做底物的最佳条件下PHA 累积合成量（57.34%）差距较大，原因可能是以下几点：①进行批次合成试验的污泥菌群并未经实际污泥水解液在SBR 反应器中驯化，当实际污泥水解液作为底物时，混合菌群由于对反应体系环境的不适应，导致对底物摄取速率较慢，进而导致了PHA合成率的下降；②实际污泥水解液中溶解性有机物除了可以作为碳源的SCFAs，还含有蛋白质、多糖等物质，对微生物的碳源的摄取速率造成一定影响，进而对PHA的合成效果产生影响，贾倩倩和赵丽智的研究结果也佐证了这一猜想；③实际污泥水解液进行脱氮除磷时，未能将氮、磷含量减少至最佳PHA 合成条件，导致了体系中难以达到最佳的PHA合成效果。

3 结论

本文启动两种不同接种污泥的序批式反应器（SBR），按照ADF 模式富集PHA 产生菌，研究活性污泥复合菌群以模拟APG 协同FNA 预处理剩余污泥的水解液为底物的PHA 合成效果，考察了批次合成实验中pH、C/P和C/N比对PHA合成量的影响，探究了实际的APG 协同FNA 预处理剩余污泥的水解液为底物时PHA 合成效果，得到的结论如下。

（1）不同接种污泥类型对反应器富集驯化有一定影响，短时间内，接种以葡萄糖为底物驯化成熟的产PHA 混合菌的SBR2 能够更好富集PHA 合成菌，获得较高的PHA 合成量。但随着驯化时间的延长，接种二沉池污泥的SBR1得到的PHA产生菌性能更优。

（2）以模拟FNA 预处理协同APG 处理剩余污泥水解液为底物，COD 浓度为1200mg/L、驯化时长达117天时，接种二沉池污泥的得到的PHA产生菌反应器周期监测中PHA 最大合成量为12.54%，合成批次试验的PHA合成量为51.66%。

（3）模拟FNA预处理协同APG处理剩余污泥水解液为底物时，PHA合成最佳条件为：pH=8，C/P=100∶0.03，C/P=125∶1。此 时PHA 合 成 量 为57.34%。

（4）实际的APG 协同FNA 预处理剩余污泥的水解液为底物时，PHA的累积合成量为24.43%。