基于对氨基苯酚的芦丁分子印迹电化学传感器的制备及应用

王 曼，孟戎茜，周兴隆

（太原工业学院化学与化工系，山西 太原 030008）

引言

芦丁（rutin，Rt）又称芸香苷，属于生物类黄酮，有着很好的药理性质[1]。芦丁也称维生素P，可增强毛细血管壁，具有细胞保护、降低炎症和抗病毒[2-3]等作用。分析芦丁的方法有很多，已发表测定芦丁含量的方法有HPLC、CE、ECL 和FILDS 等。相比常用检测方法，分子印迹传感器具有选择性强、检测线低、成本低等优点。分子印迹技术（molecular imprinting technology,MIT）是指在模板分子上留下特异匹配功能单体的空腔，从而制备具有特异选择性的聚合物[4]。由于具有很好的识别性和实用性等特点，至今MIT在很广的领域进行了研究，包括色谱分离、固相萃取、模拟酶催化、生物医药等，并且在检测传感技术领域的应用取得了长足进展。分子印迹技术示意图见图1。

图1 分子印迹技术示意图[6]

电化学传感器能将被检测物质的浓度和所反馈的电信号连结在一起，从而提供被检测体系的信息[5]。电化学传感器因为反馈信息快、操作容易、低成本等优势，在食品分析和医疗检测等领域有着广泛的应用。

分子印迹聚合物（MIPs）对模板分子有优异的选择吸附性，MIPs 稳定、易保存，因此，由此制备的分子印迹电化学传感器有着更高的识别性和适应环境的能力。所以在药物分析及其他领域，分子印迹电化学传感器应用广泛。

本文是通过构建一种分子印迹电化学传感器，来对芦丁进行检测研究，最终使得芦丁的回收率达到目标结果。

1）考察电极制备、检测条件，并将最佳的条件用于修饰电极，使得电极对芦丁有良好的选择性。

2）确定不同浓度RT 与检测出的响应电流之间的线性关系。再根据线性关系的浓度范围确定研磨芦丁成品的实际量。

3）进行阻抗实验，比较MIP/GCE 电极洗脱前、洗脱后、富集后、非印迹液洗脱后测芦丁的阻抗大小。

4）用修饰后的电极检测一定浓度比的芦丁成品与芦丁标准溶液的混合溶液的芦丁回收率，多次实验得出平均回收率。

1 实验部分

1.1 处理GCE

分别使用0.3 mm、0.05 mm 的氧化铝浆对玻碳电极进行打磨。过程中，按“8”字形的打磨方式进行。用去离子水洗净。

在铁氰化钾溶液中，采用CV 法对电极进行校正检测，最后观察峰电位，要求氧化还原峰差在90 mV 以内，再得以进行后续的操作。

1.2 溶液的配制

配制12.5 mmol/L 芦丁溶液：称取0.194 7 g 芦丁，用无水乙醇定容至25 mL。

配制2 mmol/Lp-AP 溶液：称取0.005 5 g 对氨基苯酚固体，置入10 mL 0.05 mol/L 硫酸溶液，再进行超声溶解。

配制质量浓度比为4∶1 的p-AP 与芦丁聚合物溶液：量取1 mL 芦丁溶液加入含有0.005 5 g P-AP 的非印迹溶液中，再用0.05 mol/L 硫酸溶液定容至25 mL 容量瓶中。随后按照相同的方法分别配置2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1 不同浓度的聚合物比例。

配制0.05 mol/L 硫酸溶液：称量2.72 mL 98%的浓硫酸，用去离子水定容至1 L。

洗脱液的配制：10 mL 的无水乙醇溶液和10 mL氢氧化钠溶液。

配制乙酸缓冲溶液：依次配制pH 分别为2.20、2.86、3.35、3.74、4.24、4.68 的乙酸缓冲溶液。

配制氢氧化钠：称取2.083 g 氢氧化钠，用去离子水定容至100 mL。

1.3 沉积圈数的考察

将清洗干净的玻碳电极放入先前配置的聚合物溶液中，在循环伏安法下依次改变沉积圈数（8、12、16、20、24、28 圈）对电极进行沉积，沉积参数为扫速：0.1 V/s，扫描范围：-0.2 V～0.8 V。然后将修饰过的电极经洗脱后放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集10 min，再在扫描速度为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录不同沉积圈数的电极对混合溶液检测的CV 曲线。通过对比不同圈数的峰电流大小，确定最佳沉积圈数。

1.4 分子印迹聚合物比例的考察

分别配制p-AP 与RT 的浓度比为6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1 的聚合物溶液。在0.1 V/s 扫速、-0.2 V～0.8 V 扫描范围，沉积圈数为12 圈的条件下依次按比例对玻碳电极进行沉积。然后将修饰过的电极经洗脱后放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集10 min，再在扫速为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录不同分子印迹聚合物比例的电极对混合溶液检测的CV 曲线。通过对比不同分子印迹聚合物比例的峰电流大小，确定最佳分子印迹聚合物比例。

1.5 洗脱时间的考察

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，0.125∶1 的分子印迹聚合物比例。在此沉积条件下对玻碳电极进行沉积。然后选择洗脱时间为35、45、55、65、75 min 依次对玻碳电极进行洗脱。将洗脱完的电极放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集10 min，再在扫描速度为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录不同洗脱时间的电极对混合溶液检测的CV 曲线。通过对比不同洗脱时间CV 曲线的峰电流大小，确定最佳洗脱时间。

1.6 富集时间的考察

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，0.125∶1 的分子印迹聚合物比例，55 min 的洗脱时间。在此沉积条件下对玻碳电极进行沉积。然后将修饰过的电极经洗脱后放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集0、2、5、8、10、12、15、18 min，再在扫描速度为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录不同富集时间的电极对混合溶液检测的CV 曲线。通过对比不同富集时间的峰电流大小，确定最佳富集时间。

1.7 扫描速度的考察

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，0.125∶1 的分子印迹聚合物比例，55 min 的洗脱时间。在此沉积条件下对玻碳电极进行沉积。然后将修饰过的电极经洗脱后放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集12 min，再在扫描速度为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V工作站中对其进行检测，记录不同扫速的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

1.8 乙酸缓冲液pH 的考察

用冰醋酸和无水乙酸钠分别配制pH 为2.20、2.86、3.35、3.74、4.24、4.68 的乙酸缓冲液备用。

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，0.125∶1 的分子印迹聚合物比例，55 min 的洗脱时间。在此沉积条件下对玻碳电极进行沉积。然后将修饰过的电极经洗脱后放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集12 min，混合溶液中加入的乙酸缓冲溶液pH 分别是2.20、2.86、3.35、3.74、4.24、4.68。再在扫描速度为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录CV 曲线。

1.9 线性关系和线性范围的考察

在电化学工作站中设置参数，0.1V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，0.125∶1 的分子印迹聚合物比例，55 min 的洗脱时间。在此沉积条件下对玻碳电极进行沉积。然后将修饰过的电极经洗脱后放在10 μmol/L 的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集12 min，混合溶液中芦丁的浓度分别为0.25、0.5、0.7、1.0、1.5、5、7.5、8、9.5、10 μmol/L。再在扫描速度为0.05V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录不同芦丁浓度的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

处理CV 图上的峰电流值数据，并在坐标系中以此为y 轴，芦丁浓度为x 轴作散点图。绘制出响应峰电流与芦丁浓度标准曲线，构建线性关系，并确定与其对应的线性范围。

1.10 阻抗实验

阻抗实验一共进行4 组，分别是印记液洗脱前进行表征、印记液洗脱后进行表征、印记液经富集后进行表征以及非印记液经洗脱后进行表征。

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，然后对将玻碳电极放在溶液中进行沉积。沉积结束将玻碳电极放在铁氰化钾溶液中，对电位进行估测，最后使用阻抗曲线检测，记录曲线。

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，然后对将玻碳电极放在溶液中进行沉积。沉积结束将玻碳电极放在洗脱液中洗脱55 min，之后将其放在铁氰化钾溶液中，对电位进行估测，最后使用阻抗曲线检测，记录曲线。

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，然后对将玻碳电极放在溶液中进行沉积。沉积结束将玻碳电极放在洗脱液中洗脱55 min，之后放入乙酸缓冲溶液-芦丁混合液中富集12 min。然后将其放在铁氰化钾溶液中，对电位进行估测，最后使用阻抗曲线检测，记录曲线。

在电化学工作站中设置参数，0.1 V/s 的扫描速度、-0.2 V～0.8 V 的电位范围，12 圈的沉积圈数，然后对将玻碳电极放在非印迹溶液中进行沉积。沉积结束将玻碳电极放在洗脱液中洗脱55 min，之后将其放在铁氰化钾溶液中，对电位进行估测，最后使用阻抗曲线检测，记录曲线。

对比4 组数据，得出结论。

1.11 芦丁片实品检测实验

沉积参数为扫描速度0.1 V/s，扫描范围：-0.2 V～0.8 V，圈数12 圈，分子印迹聚合物比例0.125∶1，洗脱时间55 min。在此沉积条件下对玻碳电极进行沉积。取2 片芦丁片，研磨、过滤、用无水乙醇定容至25 mL。然后将修饰过的电极经洗脱后放在加入20 μL 芦丁样品溶液的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集12 min，再在扫速为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录芦丁实物混合液检测的CV 曲线。通过响应峰电流，带入线性关系将其转化成对应的实物样品溶液浓度。之后，依次考察80%的芦丁标准液加100%的芦丁成品液、100%的芦丁标准液加100%的芦丁试样液、120%的芦丁标准液加100%的芦丁成品液。分别记录CV 曲线，观察响应峰电流，将数据代回线性方程求出对应的浓度，最后计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 电极分子印迹电化学传感器沉积圈数的确定

分别采用6 种不同的沉积圈数在玻碳电极上进行沉积，记录不同沉积圈数的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

从图2 可以看出，沉积圈数为12 圈时，响应峰电流达到最大值，而随着沉积圈数的减少或增加，响应峰电流都表现出小幅度的下降。所以在后续实验中，对电极的沉积圈数选择为12 圈。

图2 沉积圈数对响应峰电流的影响

2.2 分子印迹聚合物比例的确定

分别采用7 种不同的p-AP 与Rt 的比例，记录不同分子印迹聚合物比例的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

由第4 页图3 可以看出，随着浓度比例的增大，芦丁的电响应都随之减小，当浓度比例为0.125∶1时，由于所称取p-AP 的质量已经很低，再继续减少p-AP 的质量可能会降低对峰电流的检测的效果，故选择最佳的聚合物比例为0.125∶1。

图3 分子印迹聚合物比例对响应峰电流的影响

2.3 洗脱时间的确定

分别用6 种不同洗脱时间对修饰后的玻碳电极进行洗脱，记录不同洗脱时间的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

由第4 页图4 可以看出，最高峰电流的洗脱时间为55 min，以10 min 为单位，不论是减少或增加对电极的洗脱时间，表现出来的峰电流高度都会有着明显的下降。同时，在进行先洗脱40 min，再洗脱15 min 的情况下，所表现出的峰电流最强。所以在后续实验中，所选择的洗脱时间为二次洗脱的55 min。

图4 洗脱时间对响应峰电流的影响

2.4 富集时间的确定

分别用8 种不同的富集时间来检测最后芦丁的电响应程度，记录不同富集时间的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

从图5 可以看出，电响应随着电极在芦丁混合溶液中富集时间的增加先升高再降低，在富集时间为12 min 时达到最高，随之产生轻微的下降。导致此现象的原因可能是因为最开始由于空腔的存在，芦丁会一直选择性吸附在模板分子上，所以在12 min前，响应峰电流响应增加，而在之后，由于富集时间过长，电极表面的芦丁会掉落一些，重新回到溶液，所以电流响应会下降。

图5 富集时间对响应峰电流的影响

2.5 扫描速度的确定

分别采用6 种不同的扫描速度来检测芦丁，记录不同扫速的电极对混合溶液检测的CV 曲线，最后整合在一个坐标系内。

由图6 可以看出，随着扫描速度的增加，响应峰逐渐升高，表明该实验过程是一个吸附过程。

图6 对扫描速度的考察

2.6 pH 的确定

分别采用6 种不同的pH 缓冲溶液，记录不同pH 的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

由图7 可知，随着pH 的变化，峰电流并没有表现出绝对的规律，但在重复实验下，当pH 为4.24时，响应峰电流显然高于其他情况，故最佳pH 为4.24。

图7 pH 对响应峰电流的影响

2.7 线性关系及线性范围的确定

分别检测了10 种不同浓度的芦丁，记录不同芦丁浓度的电极对混合溶液检测的CV 曲线。

由第5 页图8 可以看出，响应峰电流与芦丁浓度存在一定的联系，分为小浓度的芦丁浓度[图8A）]和大浓度的芦丁浓度[图8B）]。其中小浓度是在0.2 μmol/L～1.6μmol/L 的浓度范围内，响应峰电流与RT 浓度的线性直线为I=1.1196×10-6c+6.27×10-9，R2=0.987 7；大浓度在5 μmol/L～10 μmol/L 的浓度范围内，响应峰电流与RT 浓度的线性直线为I=2.101 3×10-7c+9.625 7×10-7，R2=0.987 8。

图8 芦丁浓度和响应峰电流的线性关系

2.8 阻抗结论

在洗脱前、洗脱后、富集后及非印迹电极依次放在铁氰化钾中进行阻抗实验，记录实验曲线图。

由图9 可以看出，由于在沉积后会有芦丁附着在电极表面，而芦丁的导电性并不好，所以沉积后的电阻是最大的，又因为富集过程中，芦丁会进入分子印迹的空穴，因此就会使电极阻抗进一步增大，而在洗脱后，由于附着在电极表面的芦丁已经洗脱干净，因此电极表面的电阻是最小的。

图9 阻抗表征图

2.9 芦丁片成品检测

本论文检测芦丁回收率采用2 片芦丁片进行研磨、溶解。然后将修饰过的电极经洗脱后放在加入20μL 芦丁样品溶液的芦丁-乙酸缓冲溶液混合液中富集12 min，再在扫描速度为0.05 V/s，扫描范围为0 V～0.7 V 工作站中对其进行检测，记录芦丁实物混合液检测的CV 曲线。通过响应峰电流，带入线性关系将其转化成对应的实物样品溶液浓度。之后，依次考察不同比例的芦丁成品液。分别记录CV 曲线，观察响应峰电流，将数据代回线性方程求出对应的浓度，最后计算回收率和芦丁片的质量分数。见表1。

表1 样品回收率表

3 结论

本文用于芦丁的检测，构建了一种基于对氨基苯酚的分子印迹电化学传感器。研究了不同制备和检测条件响应峰电流的影响。用洗脱前、洗脱后、富集后及非印迹电极在铁氰化钾溶液中进行阻抗表征。最后用最佳的制备检测条件来对芦丁片进行实物样品的检测，计算出回收率。具体结论如下：

1）最优制备条件是沉积圈数12 圈，分子印迹聚合物浓度比例为0.125∶1。

2）最优的检测条件是洗脱时间为55 min，富集时间为12 min，最佳缓冲液pH=4.24。

3）在扫速实验中，表明了此次实验过程是一个吸附过程。

4）在小浓度范围即0.2μmol/L～1.6μmol/L内，线性关系为I=1.119 6×10-6c+6.27×10-9，R2=0.987 7；在大浓度范围即5 μmol/L～10 μmol/L 内，线性关系为I=2.101 3×10-7c+9.625 7×10-7，R2=0.987 8。

5）在阻抗实验中，洗脱前、洗脱后、富集后及非印迹电极，这四种电极在铁氰化钾溶液中进行检测，结果表明洗脱后的阻抗最小。

6）计算回收率时，得出平均回收率为94.84%，质量分数为39.22%。