保健酒的配制及其羟基自由基清除率的测定

王英特，张媛媛，王 昕，段 蓉，王云霞，Hai Woong Lee

（1.山西大学化学化工学院，山西 太原 030006；2.山西绿膳源酒业有限公司，山西 太原 030063；3.韩国东义大学韩医学科，韩国 釜山 47227）

引言

羟基自由基（·OH）被认为是人体新陈代谢产生的活性最强的活性氧[1-2]，在体内的半衰期约为9 s～10 s，具有极强的氧化能力。过量的·OH 能够通过加成反应、电子转移、脱氢等多种方式与生物体内的分子发生相互作用致使脂类、核酸等物质发生氧化性损伤[3-4]，同时也会引发蛋白质变性、酶失去活性[5-6]，最终导致机体衰老或者引起肿瘤、糖尿病[7]等诸多疾病的发生。·OH 清除剂能抑制·OH 产生的损伤，维持机体正常的生命代谢。有效的·OH 清除剂对于阻止生命体病变、衰老等具有实际意义[8-9]。

保健酒中通常含有来源于植物和中草药提供的抗氧化剂，能够阻止氧化反应的发生（干扰链式反应、氧自由基初始反应），有效清除机体内·OH[10]，致使保健酒清除自由基功效日益被重视[11-12]。钟文武、普贵宏等[13]对自制红葡萄保健酒抗氧化活性进行测定，结果表明，对1，1-二苯基-2-苦肼（DPPH）自由基清除率为54.41%，·OH 清除率为67.31%，说明自制红葡萄酒有一定的抗氧化活性。由此可见，选取有效的抗氧化能力强的中草药是提高保健酒·OH 清除率的重要环节。山西是我国传统的中药材主产区，道地药材大约30 余种，其中，黄芪、党参、远志、连翘是4 种具有代表性的药食同源中药材。系统地研究山西药食同源道地药材的·OH 清除功能，可为道地药材用于提高保健酒的·OH 清除效果提供理论依据，为药食同源中药材在保健酒领域的应用提供具有实际应用价值的指导[14]。

本文以罗丹明B（RB）为显色剂[15]，由Fenton 体系（Fe2+-H2O2）产生的·OH，可以迅速氧化RB 溶液使其褪色，利用紫外-可见分光光度法测定溶液在554nm处吸光度的变化，可确定·OH 的产生量；保健酒可以消除溶液中的·OH，从而使溶液的吸光度下降程度减弱；保健酒加入体系前后吸光度的差值（ΔA）与保健酒对·OH 的清除率成正比，据此建立了一种测定保健酒·OH 清除率的方法。实验从4 种药食同源的山西道地药材（黄芪、党参、远志、连翘）中优选·OH 清除率高的药材，以太原市非物质文化遗产黄米白酒为基酒，炮制功能保健酒。结果表明，中药和酒的协同效应更有助于提升保健酒对人体内·OH清除功能，从而使保健酒的抗氧化性更具优势[16-17]。本研究可为开拓现代食药用途、开发功能性保健酒提供理论和技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

紫外-可见分光光度计，UV-2450，岛津公司；电子分析天平。

过氧化氢（H2O2）；罗丹明B（C28H31ClN2O3）；硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）；抗坏血酸（C6H8O6）；稀硫酸（H2SO4）；黄米白酒基酒，35%（体积分数），山西绿膳源酒业有限公司提供；中药（党参、黄芪、连翘、远志等），同仁堂药店购买；实验用水均为去离子水。

1.2 试剂的制备

1.2.1 H2O2 溶液的配制

按“GB 1616—1988 H2O2含量的测定”标定市售体积分数为30%的H2O2溶液。准确移取H2O2溶液27 μL 于25.00 mL 容量瓶中，加入去离子水定容至刻度，得到1.05×10-2mol/L H2O2溶液。

1.2.2 Fe2+溶液的配制

准确称取FeSO4·7H2O 0.073 g 于小烧杯中，加入适量去离子水溶解，并加入一定量的0.5 mol/L 稀H2SO4溶液，转移至25.00 mL 容量瓶中，以去离子水定容至刻度，得到浓度为1.05×10-2mol/L 的FeSO4溶液。

1.2.3 RB 溶液的配制

准确称取RB 0.012 g 于小烧杯中，加入适量去离子水溶解，转移至250.00 mL 容量瓶中，以去离子水定容至刻度，得到浓度为1.00×10-4mol/L RB 储备液；准确移取储备液1.75 mL 于25.00 mL 容量瓶中，以去离子水定容至刻度，得到浓度为7.00×10-6mol/L RB 工作溶液。

1.2.4 抗坏血酸溶液的配制

准确称取抗坏血酸0.092 g 于小烧杯中，加入适量去离子水溶解，转移至25.00 mL 容量瓶中，以去离子水定容至刻度，得到浓度为2.00×10-2mol/L 抗坏血酸溶液。

1.2.5 中药水提液制备

选取党参、黄芪、连翘、远志4 种中草药，清洗晾干，然后将其粉碎过筛。称取上述药材1.0 g，加入20.00 mL 蒸馏水，水浴加热0.5 h，趁热过滤，得到4种中药的水提取液进行测定。

1.2.6 党参、黄芪保健酒制备

称取5.0 g 粉末状党参、黄芪中药药材于烧杯中，加入50.0 mL 黄米白酒，搅拌均匀，转入封口瓶中炮制30 d 后，过滤，分别得到党参、黄芪保健酒。

1.3 ·OH 反应机理及清除率的计算

根据Fenton 反应[18]，H2O2为氧化剂，以Fe2+为催化剂的氧化法，其反应机理如式（1）～式（4）。

通过Fenton 反应产生的·OH 能够迅速氧化RB溶液，使体系的吸光度降为A；抗氧化剂具有清除·OH 能力，体系的吸光度降低程度减弱为As；空白溶液RB 显色剂吸光度为Ao，则·OH 清除率计算公式[19]如式（1）。

1.4 样品测定

1.4.1 最大吸收波长的选取

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 内进行光谱扫描，记录体系的紫外吸收光谱，确定其最大吸收波长为554 nm，该吸收峰记录为体系的空白吸收峰，此时的最大吸光度为Ao。

1.4.2 ·OH 的测定

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、20 μL H2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm内进行光谱扫描，记录反应体系的紫外吸收光谱，此时的最大吸光度为A。

1.4.3 ·OH 清除率的测定

由于·OH 在体系中存在的时间较短，为充分保证Fenton 体系产生的·OH 能够及时与RB 及抗氧化剂发生反应，故·OH 清除率的测定实验中试剂加入顺序依次为：RB→Fe2+→抗氧化剂→H2O2。

1.4.3.1 抗坏血酸（对照）

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、32 μL 抗坏血酸溶液（2.10×10-2mol/L）、20 μLH2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 内进行光谱扫描，记录紫外吸收光谱，利用此时的最大吸光度为As，根据公式（1）可计算抗坏血酸的·OH 清除率。

1.4.3.2 中药水提液

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、5.0 μL 中药水提液（党参、黄芪、连翘、远志）、20 μL H2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 内进行光谱扫描，记录紫外吸收光谱，利用此时的最大吸光度为As，根据公式（1）可计算中药水提液的·OH 清除率。

1.4.3.3 保健酒

移取3.00 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、5.0 μL 已稀释10 倍的保健酒、20 μL H2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 内进行光谱扫描，记录紫外吸收光谱，利用此时的最大吸光度为As，根据公式（1）可计算保健酒的·OH 清除率。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 pH 值的影响

Fenton 反应在H2SO4介质中进行。如前所述，由Fenton 体系（Fe2+-H2O2）产生的·OH，可以迅速氧化RB 溶液使其褪色，为了探究pH 值对体系褪色的影响，调节反应体系的pH 值依次为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，测定不同pH 值下体系吸光度变化值ΔA（ΔA=Ao-A）。如第11 页图1 所示，在体系的pH 值为4 时，ΔA 值有最大值，信号最强，说明·OH 在此条件下产生量最大。因此，本实验设置H2SO4溶液pH 为4 进行后续测试。

图1 pH 值对反应体系的影响

2.1.2 Fe2+和H2O2 用量的影响

Fe2+和H2O2的用量直接影响到·OH 的产生，根据Fe2+和H2O2化学计量反应方程式，设置两者用量比为1∶1。当二者用量均为8、12、16、20、24、28 μL，体系吸光度变化值ΔA 如图2 所示。结果表明，在Fe2+和H2O2溶液用量为20 μL 时，ΔA 值基本稳定，有最大值。因此，本实验选取的Fe2+和H2O2溶液最适用量为20 μL。

图2 试剂用量对反应体系的影响

2.1.3 反应时间的影响

为了获得稳定的实验数据，对反应时间进行了控制。选取反应时间依次为2、4、6、8、10、12 min，吸光度变化值ΔA 如图3 所示。结果表明，当反应时间为8 min 时，ΔA 值基本稳定，有最大值。因此，本实验选取的最适反应时间为8 min。

图3 时间对反应体系的影响

2.2 ·OH 清除率测定结果

2.2.1 中药水提液测定结果

按照1.4.3.2 节的方法依次测定4 种（党参、黄芪、连翘、远志）中药的水提取液对·OH 的清除率。如图4 所示，发现党参、黄芪清除·OH 的能力比较强，可以达到较好的清除效果；连翘、远志清除·OH的能力次之；由表1 可看出，4 种中药水提取液对·OH 清除能力强弱顺序依次为：党参（63.74%）>黄芪（62.27%）>连翘（57.69%）>远志（56.96%）。实验选择党参和黄芪作为保健酒的药食同源原料药。

图4 中药水提液和抗坏血酸溶液对·OH 清除率测定

表1 4 种中药水提液和抗坏血酸清除·OH 能力

2.2.2 保健酒测定结果

按照1.4.3.3 节的方法依次测定保健酒对·OH的清除率。如第12 页图5 所示，与基酒的·OH 的清除率相比，加入党参和黄芪后的保健酒对·OH 的清除率均有提高，将黄米白酒的·OH 清除率由67.04%（第12 页表2）分别提高到76.82%（党参保健酒，表2）和79.39%（黄芪保健酒，表2），说明抗氧化性较高的中药材加入基酒中是提高保健酒的·OH 清除率有效途径；对比党参和黄芪2 种保健酒，虽然党参水提液（63.74%，表1）比黄芪水提液（62.27%，表1）的·OH清除率高，然而，黄芪保健酒的·OH 的清除率提高较大（79.39%，表2），高于党参保健酒的·OH 的清除率（76.82%，表2），说明酒精作为溶剂更有利于黄芪有效成分的浸出，更能有效地萃取黄芪的有效成分，进一步说明中药和酒的协同效应有利于促进保健酒的抗氧化性能的提升。与市售相同酒精度数具有抗氧化性的某品牌保健酒相比（75.93%，表2），党参保健酒的·OH 清除率与某品牌保健酒几乎相同，说明党参保健酒达到了市售保健酒抗氧化性的要求；而黄芪保健酒·OH 清除率略优于市售品牌的保健酒，说明中药和酒的协同效应提高了保健酒的抗氧化性。

图5 不同保健酒对·OH 清除率测定

表2 不同保健酒清除·OH 能力

3 结论

本文以·OH 清除率为标准，筛选具有较高·OH清除率的山西道地药材党参、黄芪制备保健酒。通过对比中药水提液和保健酒，发现将抗氧化性较高的中药材加入基酒是提高保健酒的·OH 清除率有效途径；同时，由于酒是某些中药材有效成分的优良溶剂，中药和酒的协同效应有利于促进保健酒抗氧化能力的提升。与市售酒精度数的具有抗氧化性的某品牌保健酒相比，本研究制备党参保健酒的抗氧化活性达到市售保健酒要求；黄芪保健酒略优于市售保健酒。由此可见，本文提出用·OH 清除率来评价保健酒，为行之有效的解决保健酒抗氧化性提供一个新的思路。