化浊开郁方对非酒精性脂肪肝大鼠SREBP-1信号通路的影响❋

王钰铭， 靳露露， 苗 静， 贾建伟， 徐 懂， 张翟轶， 崔换天， 温伟波， 王洪武△

(1.天津中医药大学， 天津 301617； 2.天津市第二人民医院， 天津 300000； 3.山东大学生命科学学院动物细胞与发育生物学山东省重点实验室， 山东 青岛 266000； 4.云南省中医院， 昆明 650000)

随着社会和经济的发展，人们的饮食结构和生活方式逐渐发生变化，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的发病率呈逐年上升趋势，危害明显[1]。超过10%的NAFLD可进一步发展为非酒精性脂肪肝炎，而且约20%的非酒精性脂肪肝炎可在10年内发展为肝硬化[2]。此外，NAFLD还是2型糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等众多慢性疾患的危险因素[2]。因此，寻找切实可行的早期干预措施阻断或延缓NAFLD进展至关重要。

NAFLD是一种与胰岛素抵抗和代谢紊乱相关的肝脏损伤，以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要临床特征[3]。有研究证明，细胞脂质代谢的调节者为固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)，可分为SREBP-1与SREBP-2。通过调控SREBP-1及下游乙酰辅酶A羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase，ACC)、ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase，ACLY)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)基因及蛋白表达，可减少脂肪聚集，从而缓解NAFLD的发生[4-7]。化浊开郁方组成：柴胡12 g，白芍9 g，枳实9 g，半夏9 g，大黄6 g，薄荷9 g，荷叶9 g，佩兰9 g与大柴胡汤化裁，加清热利湿功效的兰草汤，祛湿解暑之荷叶，少佐薄荷以疏肝，去生姜、大枣以防温补太过，具有消膏脂、化痰浊的功效，对NAFLD有良好的治疗作用，然而其作用机制尚不明确。本研究采用高脂饲料建立NAFLD大鼠模型，在造模期间灌胃不同剂量的化浊开郁方，同时采用二甲双胍作为阳性对照，通过观察大鼠血脂、肝组织病理学及SREBP-1信号通路表达变化，探讨化浊开郁方对NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，购自北京维通利华生物科技有限公司，动物生产许可证号SYXK(京)2019-0033。实验前将动物放置室内1周适应环境，室温(21±2)℃，标准大鼠饲料喂养，自由进食饮水。所有动物实验均经天津中医药大学动物保护与利用委员会批准，实验动物编号2019-0016。

1.2 主要试剂与仪器

高脂饲料(17.7%蔗糖，17.7%果糖，19.4%蛋白质和40%脂肪)、普通饲料(59.4%总糖，20%蛋白质和4.8%脂肪)购自北京华阜康生物科技有限公司。总胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒(货号A111-1-1)、甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒(货号A110-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒(货号A113-1-1)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)试剂盒(货号A112-1-1)，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白检测试剂盒(货号PC0020)、油红O染色试剂盒(货号G1261)，Solarbio生物科技有限公司；SREBP-1(货号bs-1402R)，北京博奥森生物科技有限公司；ACC(货号ab45174)、ACLY(货号ab40793)、FASN(货号ab22759)、β-actin(货号ab179467)和相应的二抗，Abcam公司；RNA提取、反转录、扩增试剂盒(货号DP419、KR106-02、FP205-02)，天根生物科技有限公司；ECL发光剂(货号WBKLS0500)，Millipore公司。

切片机(型号RM2125 RTS)，Leica公司；光学显微镜(型号ECLIPSE E100)，Nikon公司；冷冻切片机(型号CM3050 S)，Leica公司。

1.3 药物

化浊开郁方中药方剂由天津中医药大学第一附属医院提供。将化浊开郁方中药饮片(柴胡12 g，白芍9 g，枳实9 g，半夏9 g，大黄6 g，薄荷9 g，荷叶9 g，佩兰9 g)加入8倍量水浸泡2 h之后煎煮2次，每次煎煮30 min过滤药渣，将2次煎煮得到的汤药混合后浓缩至2 g生药/mL，4 ℃冷藏备用。

1.4 分组及给药方法

将60只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、阳性药组、化浊开郁方低、中、高剂量组6组各10只，适应性喂养1周后，正常组给予普通饲料喂养，其余各组给予高脂饲料建立NAFLD模型，共喂养12周。造模第5周开始，正常组和模型组每天灌胃0.9%氯化钠溶液2 mL；阳性药组每天灌胃二甲双胍250 mg/kg；化浊开郁方低、中、高剂量组每天灌胃化浊开郁方1.6 g生药/kg、3.2 g生药/kg、6.4 g生药/kg，各组连续给药8周。给药结束后禁食12 h，将各组大鼠麻醉处死并取材。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 血清生化指标检测 将大鼠麻醉后目内眦取血，收集血清用于检测TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

1.5.2 HE染色观察各组大鼠肝脏病理学变化 每组随机挑选6只大鼠，留取肝左叶同一部位肝组织，清洗后置于10%福尔马林固定，脱水后进行石蜡包埋。用切片机将其切成5 μm厚的切片，常规HE染色，透明密封后在光学显微镜下观察肝脏的病理学变化。通过NAFLD活动度积分(NAFLD activity score ，NAS)评价各组大鼠肝组织脂肪变性、气球样变和小叶炎症程度[8]，评分范围从0到8(总分)，评分越高表明脂肪变性、气球样变和小叶炎症程度越高(见表1)。

表1 NAFLD活动度积分(NAS)

1.5.3 油红O染色观察各组大鼠肝脏病理学变化 每组随机挑选6只大鼠，将新鲜肝组织在液氮中快速冷冻，冰冻切片机切取厚10 μm组织固定在载玻片上。5%甲醛固定，蒸馏水冲洗，60%异丙醇去除染色液。切片用Mayer苏木素染色液复染，干燥，甘油密封，立即在光学显微镜下观察。使用image pro plus 6.0测定油红O的染色面积(Area)和积分光密度值(integrated optical density,IOD), 以IOD(sum)/Area(sum)作为最终测量值。

1.5.4 荧光定量PCR检测各组大鼠肝脏中SREBP-1信号通路相关基因表达 每组随机挑选6只大鼠，分别在大鼠肝右叶距边缘1 cm处取肝组织提取总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板，按照试剂盒说明分别加入引物和SuperReal PreMix Plus，反应条件:95 ℃15 min，95 ℃20 s，56 ℃ 20 s，40循环，使用2-ΔΔCt进行数据计算(见表2)。

1.5.5 Western blot检测各组大鼠肝脏中SREBP-1信号通路相关蛋白表达 每组随机挑选6只大鼠，将肝脏组织加RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。每个样品取等量蛋白20 μg电泳、转膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h后分别加入一抗SREBP-1(1∶2 000)、ACC(1∶5 000)、ACLY(1∶5 000)、FASN(1∶5 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗(1∶8 000)，室温孵育2 h。TBST洗膜后加ECL试剂显影成像。使用Image pro plus 6.0软件对条带灰度值进行量化分析。

表2 引物序列表

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠体质量比较

造模给药后，与正常组比较，模型组大鼠体质量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药组、化浊开郁方中、高剂量组大鼠体质量显著降低(P<0.01)(见图1)。

2.2 各组大鼠血脂水平比较

造模给药后，与正常组比较，模型组血清中TC、TG、LDL-C水平显著提高(P<0.01)，HDL-C水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组与化浊开郁方中、高剂量组TC、TG、LDL-C显著降低(P<0.05，P<0.01)，HDL-C显著升高(P<0.05)(见表3)。

表3 化浊开郁方对NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平影响比较

2.3 造模给药后各组大鼠肝脏病理学变化

HE染色结果表明，正常组大鼠肝组织具有完整且清晰的肝小叶结构，肝细胞大小相似，细胞核位于细胞中央，胞质丰富，肝窦排列规则清晰可见。与正常组比较，模型组肝组织中可观察到明显的脂肪变性、气球样变、小叶炎症等病理变化，NAS评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠肝组织脂肪变性、气球样变、小叶炎症等均有不同程度改善，阳性药组、化浊开郁方中剂量组、高剂量组NAS评分显著降低(P<0.01)(见图2)。

注：图a为肝组织HE染色，图中黑色箭头代表脂肪变性，黄色箭头代表气球样变，红色箭头代表小叶炎症；图b为HE染色NAS结果评分；与正常组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01图2 各组大鼠肝组织HE染色比较(100×，n=6)

2.4 各组大鼠肝脏油红O染色

图3示，与正常组比较，模型组肝脏切片中观察到明显增多的红色脂滴(P<0.01)，呈扩散和颗粒状；与模型组比较，阳性药组、化浊开郁方低、中、高剂量组肝组织脂滴累积明显减少(P<0.05，P<0.01)。

注：图a为肝组织油红O染色图片；图b为油红O染色的量化分析结果。与正常组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01图3 各组大鼠的肝组织油红O染色比较(100×，n=6)

2.5 各组大鼠肝脏中SREBP-1信号通路相关基因表达

图4示，荧光定量PCR结果表明，与正常组比较，模型组SREBP-1、 ACC、ACLY、FASN mRNA表达均显著上调(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、化浊开郁方低、中、高剂量组SREBP-1、 ACC、ACLY、FASN mRNA表达水平均显著降低(P<0.05，P<0.01)。

注：与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)；ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)；脂肪酸合酶(FASN)图4 各组大鼠肝脏SREBP-1、ACC、ACLY、FASN mRNA表达比较(n=6)

2.6 各组大鼠肝脏中SREBP-1信号通路相关蛋白表达

图5示，Western blot结果表明，与正常组比较，模型组SREBP-1、ACC、ACLY、FASN蛋白表达均显著上调(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、化浊开郁方低、中、高剂量组SREBP-1、 ACC、ACLY、FASN蛋白表达显著降低(P<0.05，P<0.01)。

注：图a为SREBP-1、ACC、ACLY、FASN Western-blot条带；图b为灰度值量化分析结果；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，** P<0.01；胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)；ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)；脂肪酸合酶(FASN)图5 各组大鼠肝脏SREBP-1、ACC、ACLY、FASN 蛋白表达比较(n=3)

3 讨论

NAFLD属于中医学“肝癖”“胁痛”“积聚”等范畴，其基本病机多为肝郁脾虚、痰浊内蕴进而损害肝体，出现胁肋胀满、周身困重等症状[9]。病位主要在肝，与脾、胃、肾密切相关。大柴胡汤出自《伤寒杂病论》，有和解少阳、内泻热结之意，可行气开郁化痰、消膏化浊祛湿，兼破血逐瘀[10]。在既往研究中，大柴胡汤可改善NAFLD患者血脂代谢紊乱、肝内脂肪蓄积和纤维化病变[11]。化浊开郁方由大柴胡汤和兰草汤加减化裁而来，可消痰浊、开郁气，对NAFLD的治疗更具有针对性。方中柴胡、黄芩可疏肝解郁、清热解毒，具有保肝利胆的功效，可减轻肝细胞损伤[12]；大黄、枳实、半夏和白芍化痰散结，导湿通腑，可减少体内脂质蓄积[13，14]；薄荷入肝经，开郁散气，消导顺降，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化的作用[15]；荷叶生发元气，助脾胃，可有效分解体内脂肪，有良好的降脂作用[16]；兰草汤出自《黄帝内经》，其名首见于《圣济总录》，方中仅含1味兰草，即佩兰，可辟秽化湿，具有降脂、抗炎、抗肿瘤作用[17，18]。本研究使用高脂饮食建立NAFLD模型大鼠，模型组大鼠出现血脂紊乱、肝组织脂肪变性、肝细胞气球样变及小叶炎症，提示造模成功。经化浊开郁方治疗后，中剂量及高剂量组大鼠体质量显著降低，且血脂水平与肝组织病理变化明显改善，说明化浊开郁方对NAFLD具有治疗作用。此外，本研究选用二甲双胍作为阳性对照药物，结果表明化浊开郁方中、高剂量与二甲双胍疗效比较差异无统计学意义。

肝脏脂质代谢受损是NAFLD的主要特征，也是导致NAFLD的主要原因[19-20]。SREBP-1可通过调节合成肝脏细胞内胆固醇、脂肪酸、三酰甘油和磷脂所需的一系列酶，包括ACC、ACLY、FASN等表达来调节脂质代谢[21]。ACC是催化脂肪合成第一步的关键酶，将ACLY裂解产生的乙酰辅酶A羧化为丙二酰辅酶A。丙二酰辅酶A是脂肪酸生物合成的重要前体，是控制脂肪酸代谢的关键分子，最终被FASN转化为棕榈酸酯[22]。SREBP-1过度激活时会造成肝脏脂质代谢异常[23]，因此需要通过抑制SREBP-1的激活并下调其下游的ACC、ACLY、FASN，控制脂肪酸和胆固醇的合成，进而减少脂质的过度累积。本研究结果表明，化浊开郁方可下调NAFLD模型大鼠肝脏中SREBP-1、ACC、ACLY、FASN基因及蛋白表达水平，表明化浊开郁方可以通过抑制SREBP-1信号通路及其下游ACC、ACLY、FASN的活性抑制脂肪合成，进而对脂代谢紊乱起到一定的改善作用，有助于治疗NAFLD。

综上所述，化浊开郁方可有效改善NAFLD大鼠的脂质代谢状态，尤以中、高剂量最为明显，其作用机制可能与抑制SREBP-1信号通路活化有关。