不同信号肽对嵌合抗原受体T细胞杀伤作用的影响研究

李 帆，张琴星，童祥文，田高辉，顾力行，徐 瑶

武汉科技大学生命科学与健康学院 生物医学研究院，湖北 武汉430081

1975年，洛克菲勒大学细胞生物学教授Bloble等［1］在一项研究中发现新合成的蛋白质具有内源性信号，即信号肽（signal peptide，SP），最后通过实验验证，他提出了“信号假说”，用以解答蛋白质合成后的去向问题。SP是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链，能够调节前体蛋白的折叠和转移。研究［2-5］表明，在原核系统中，SP附着后，外源基因能够在原核表达系统中成功表达并分泌，如芽孢杆菌、乳酸杆菌、L型细菌、大肠杆菌等。除此之外，SP还广泛应用于真核表达系统，如昆虫杆状病毒表达系统和毕赤酵母表达系统［6-9］。由此可见，SP在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色，通过分子生物学技术，优化SP序列对于提高外源蛋白的分泌量及活性具有重要的实际意义。

嵌合抗原受体T淋巴细胞（chimeric antigen receptor T lymphocyte，CAR-T）技术是通过分子生物学和基因工程改造技术，将靶向特异性抗原的单链抗体的轻重链可变区（single chain antibody variable fragment，scFv）序列在患者的T细胞膜表面表达，进而特异性地杀死肿瘤细胞，达到治疗癌症的目的。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区（通常来源于抗体抗原结合区域的scFv段）、一个细胞外铰链区、一个跨膜区和一个细胞内信号区［10-11］。细胞膜外部分是从单克隆抗体中纯化的抗原靶向部分，该抗体由scFv（重链和轻链可变区的融合蛋白）组成。scFv中的SP对自身的表达尤为重要，scFv的N端SP具有三重结构，并且与分泌蛋白的SP具有相同的特征［12-13］：疏水性α螺旋核心（h区），其N端侧翼为极性氨基酸残基（n区）。C端侧翼在裂解位点（c区）的-1和-3处含有螺旋断裂的脯氨酸和甘氨酸残基，以及小的不带电荷的残基。scFv一旦与肿瘤抗原结合，它就会触发T细胞活化并导致细胞因子释放和T细胞增殖［14］。SP能促进CAR在T细胞膜表面的表达，因此，对SP结构进行优化和选择是提高CAR表达水平的重要方法。

本研究以CD19为CAR-T治疗靶点，通过构建4种不同SP的CD19-CAR表达载体，研究4种不同来源的SP对CAR-T转染效率的影响，并验证其对CD19阳性肿瘤细胞的杀伤效果，为临床治疗急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）提供新的CAR-T治疗方案。

1 材料和方法

1.1 细胞株与主要试剂

人胚肾细胞293T、K562细胞系和NALM-6细胞系均购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），K562-CD19细胞系为武汉波睿达生物科技有限公司馈赠，大肠杆菌DH5α感受态购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

慢病毒表达载体BRD-PTK-Kan购自武汉波睿达生物科技有限公司（自行构建并保存），慢病毒包装载体pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G均购自美国Addgene公司，大量质粒抽提试剂盒购自美国Axygen公司，胎牛血清、DMEM-Basic、RPMI-1640培养基及0.25%的Trypsin-EDTA均购自美国Gibco公司，PE-Labeled Human CD19 Protein购自北京百普赛斯生物科技有限公司，7-AAD购自美国BD Bioscience公司，钙黄绿素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Human IFN-γ precoated ELISA kit（Cat:1110002）和Human TNF-α precoated ELISA kit（Cat:1117202）ELISA试剂盒购自深圳达科为生物科技股份有限公司。寡核苷酸引物由武汉擎科生物科技有限公司合成。

1.2 4种不同SP的CD19-CAR分子的设计

CD19-CAR分子的单链抗体片段来源于GenBank：HM852952.1，将细胞外域CD19-scFv（包含SP1序列）、跨膜区、细胞内域共刺激因子CD28、4-1BB及CD3ζ依次串联连接，获得完整的CD19-CAR片段，CD19抗原的scFv可在细胞膜上稳定表达。然后通过分子克隆技术将SP2、SP3、SP4替换CD19-CAR中原有的SP1，即可得到含不同SP的CD19-CAR分子。SP序列如表1所示。

表1 SP的核苷酸和氨基酸序列及来源Tab.1 Nucleotide and amino acid sequences and sources of SP

1.3 分子重组技术构建不同SP的PTK-CD19-CAR 载体

通过基因合成得到序列大小为792 bp的CD19-scFv序列，包括SP1、VL轻链、Linker连接肽和VH重链。此外，基因合成得到大小为804 bp的基因序列，包括hinge、共刺激因子CD28、41BB及CD3ζ等结构。

通过重叠PCR 技术，将上述两段序列连接，得到CD19-CAR 片段，然后使用引物CAR-F、CAR-R（表2），扩增获得不含SP1的CAR片段。用表2的引物序列分别扩增基因合成的SP2、SP3、SP4，使其带有相同的同源臂，然后与不含SP1的CAR片段连接即可获得含有不同SP的CD19-CAR片段。随后，通过BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，利用亚克隆技术将其连接至慢病毒表达载体BRD-PTK-Kan。最终获得分别含4种SP的CD19-CAR目的载体，即SP1-CD19-CAR、SP2-CD19-CAR、SP3-CD19-CAR和SP4-CD19-CAR，用于慢病毒包装。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.4 细胞培养

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养K562细胞系、K562-CD19细胞系和NALM-6细胞系。HEK-293T细胞培养使用含10%胎牛血清的 DMEM培养基，原代T细胞培养使用含1 000 U/mL IL2、1∶1 000的HEPES 1M、1∶1 000谷氨酰胺的TexMACS™ GMP培养基；细胞通过添加或替换新鲜培养基维持生长，换液需要300×g离心5 min 去细胞上清，然后按2×106～3×106个/mL 的细胞密度添加培养基，轻轻吹打均匀后置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。

1.5 慢病毒的包装、浓缩及滴度测定

利用第3代慢病毒包装系统，由慢病毒包装载体pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G和慢病毒表达质粒组成。用PEI转染法将慢病毒系统4种质粒共转染HEK-293T细胞，转染比例为12∶10∶6∶5，然后37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养72 h后收集上清液，采用超速离心法进行浓缩。滴度测定：采用6孔板，每孔铺5×105个HEK-293T细胞，每孔分别加入0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 µL的病毒，并加入聚凝胺（polybrene），使其浓度为5 µg/mL 。并设置阴性对照，72 h后通过PE-Labeled Human CD19 Protein用流式细胞术检测HEK-293T细胞转染效率并计算慢病毒滴度。每种病毒量设置2 组平行孔，实验重复3 次。

1.6 慢病毒转导T细胞构建CD19-CAR-T

显微镜下观察待转染细胞生长情况，取需要数目的生长状况良好的待转细胞；于6孔板中按感染复数等于5计算需要加入慢病毒浓缩液的量，补加Polybrene使其终浓度为5 µg/mL；37 ℃斜置温育4 h，最后补加培养基至正常培养浓度。

1.7 流式细胞术检测慢病毒感染T细胞表面CD19-CAR的表达

收集＞5×105个转染待测转效或表面表达的细胞于流式管中，并选取未染色或未处理细胞作为阴性对照。向每管中加入1～2 mL流式细胞术用Buffer（PBS＋2%～5%FBS，FBS维持细胞活性），300×g，离心5 min，去掉上清液，重复洗2遍，用流式细胞术用Buffer配制好工作浓度的染色抗体，并除尽离心后的上清液，重悬细胞于配制好的抗体中，4 ℃避光染色30 min。加入1～2 mL流式细胞术用Buffer终止染色，300×g，5 min离心，去掉上清液，重复洗2遍，加 2 µL 7-AAD 抗体（稀释比例 1∶100）于 0.2 mL流式细胞术用Buffer中重悬细胞，2～3 h之内流式细胞仪分析检测。

1.8 钙黄绿素释放法检测各种SP CD19-CAR-T的细胞毒性

以T、SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19 和SP4-CD19细胞作为效应细胞，阳性靶细胞为表达CD19的NALM-6细胞系和K562-CD19细胞系，阴性靶细胞为不表达CD19的K562细胞系。将靶细胞用calcein-AM 标记后，将其接种于U底96孔培养板（100 µL/孔），接种密度为1 × 105个/mL。将体积为100 µL/孔，不同效靶比（25∶1、5∶1、1∶1）的效应细胞加入对应孔中，共培养体系用含5%胎牛血清的PBS。设置：阳性对照组（加入裂解液）和阴性对照组（加入 PBS），各组均设 4个复孔，37 ℃生化培养箱中温育3 h。将96 孔板在常温下700×g离心10 min，将每个孔中所有的上清转移至新的平底96孔板预标记的对应的孔中。分参数设置酶标仪：激发光波长485/20，发射光波长530/25，扫描读取荧光值。各组效应细胞的细胞毒性根据以下公式计算：特异性杀伤百分率（%）=（实验组荧光值-阴性对照组荧光值）/（最大释放组荧光值-阴性对照组荧光值）×100%，实验重复3 次。

1.9 ELISA法检测各种SP CD19-CAR-T内IFN-γ和TNF-α的分泌水平

取适量的靶细胞，加入5×103个K562细胞于96孔板中，作为阴性靶细胞组，阳性靶细胞组加入5×103个CD19＋的NALM-6 细胞，而空白组中不加入靶细胞，体积为100 µL。按照效应细胞比靶细胞为10∶1，加入T 细胞和4种SP的CD19-CAR-T（5×104个/孔，体积100 µL）于对应的孔中，每个样品做3个复孔，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为共培养体系。37 ℃生化培养箱中温育24 h后，将96 孔板常温，700×g，10 min离心后收集100 µL上清液，按酶联免疫吸附实验试剂盒的说明书常温操作检测IFN-γ和TNF-α的分泌水平，在450 nm波长下检测吸光度（D）值，并根据标准曲线计算各样本细胞因子的含量（pg/mL）。

1.10 数据分析

本研究采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析，实验数据以表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建分别含4种SP的CD19-CAR 重组质粒

利用基因合成和分子克隆技术成功获得了含不同SP的CD19-CAR片段（图1A），将4种CD19-CAR分子亚克隆至慢病毒载体BRD-PTKKan上。通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切进行鉴定，CD19-CAR分子的重链VH结构含有BamHⅠ酶切位点，则CD19-CAR分子被切成一段带SP的序列和一段大小为1 052 bp大小的序列。结果显示，含4种SP的重组质粒酶切后可见4条带SP的序列大小分别为 544、547、550和541 bp，两段序列加起来的大小与携带不同SP的CD19-CAR片段一致（图1B）。此外，载体测序结果证实，4种CD19-CAR片段基因序列和插入的阅读框与设计完全相符，证明4种慢病毒表达质粒SP1-CD19-CAR、SP2-CD19-CAR、SP3-CD19-CAR和SP4-CD19-CAR构建成功。

图1 含4种不同SP慢病毒表达载体的构建Fig.1 Construction of recombinant lentiviral plasmid containing four different SP

2.2 成功制备4种慢病毒载体

流式细胞术检测结果显示，用浓缩的4种病毒液分别以 0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 µL的体积转染HEK-293T细胞，以病毒添加量为0.4 µL 时计算对应的4 种慢病毒（S P 1、SP2、SP3和SP4）的滴度。结果显示，SP4［（2.80±0.10)×108TU/mL］慢病毒的滴度显著高于SP1［（1.40±0.09)×108TU/mL］、SP2［（1.70±0.11)×108TU/mL］、SP3［（2.10±0.19)×108TU/mL］（P＜0.01，图2A），证明4种慢病毒包装成功，可用于后续实验。此外，如图2B所示，病毒添加量为0.4 µL时对应的4种慢病毒（SP1、SP2、SP3和SP4）的转染效率分别为11.3%、13.1%、16.6%和23.5%。

图2 4种慢病毒的成功制备Fig.2 Successful preparation of four lentiviruses

2.3 4种不同SP的CD19-CAR在T细胞中的表达差异分析

通过流式细胞术检测不同SP对CAR-T转染效率的影响，结果如图3所示，转染效率随着时间的延长呈现先上升后下降的趋势，且SP4-CD19组显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19组（P＜0.05）（图3A）。并且在转染效率最高的第6天检测4组慢病毒感染组的表达情况，结果显示，含4种SP的慢病毒（SP1、SP2、SP3和SP4）感染的T细胞成功表达CD19-CAR的比例分别为20.9%、22.6%、31.5%和38.6%（图3B）。此外，本研究还检测了相同时间点CD19阳性细胞的数量，结果显示，SP4-CD19组的阳性细胞数均高于其他3组（图3C），细胞增殖实验结果显示，含不同SP的CAR结构对CAR-T细胞的增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05，图 3D）。

图3 4种CD19-CAR分子在T细胞中的转染效率及增殖情况Fig.3 Transfection and expression rate of four CD19-CAR in the T cells and its proliferation activity

2.4 4种不同SP的CD19-CAR-T对靶细胞的杀伤效率

本研究通过流式细胞术进一步检测4种SP的CAR-T的体外杀伤效力，实验选择不表达CD19的K562细胞作为阴性靶细胞，K562-CD19细胞（CD19稳定表达细胞系）和NALM-6细胞（CD19表达阳性率为99.6%和99.5%），作为阳性靶细胞（图4A）。

细胞毒性实验结果（图4B）显示，用第6天的CAR-T杀伤靶细胞，在效靶比相同的条件下SP4-CD19细胞对K562-CD19肿瘤细胞的杀伤作用显著高于SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19细胞和T细胞［效靶比为25∶1时，分别为（36.77±2.42）%、（15.15±1.35）%、（18.80±0.30）%、（31.58±1.47）%、（9.04±3.25）%，P＜0.01］。同样SP4-CD19细胞对NALM-6肿瘤细胞的杀伤作用明显高于SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19和T细胞［效靶比为25∶1时，分别为（23.43±1.13）%vs（11.16±0.48）%、（10.54±2.27）%、（1 7.9 0±1.5 3）%和（8.2 7±2.7 5）%，P＜0.01］。而两者对CD19-肿瘤细胞K562的杀伤作用差异无统计学意义［效靶比为25∶1 时，分别为（3.75±0.95）%vs（3.06±0.80）%、（2.4 2±0.7 9）%、（4.0 0±1.0 6）%和（1.92±0.76）%，P＞0.05］。

图4 4种CD19-CAR-T对CD19+靶细胞的杀伤效应Fig.4 Killing effect of four CD19-CAR-T on CD19+ target cells

2.5 4种不同SP的CD19-CAR-T中IFN-γ和TNF-α的分泌

前期研究发现，细胞因子IFN-γ和TNF-α可发挥协同作用杀死肿瘤细胞，因此本研究采用ELISA技术检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的释放情况［15-16］。结果显示，效靶比为10∶1 时，共培养24 h后，阳性靶细胞组与空 白 细 胞 组 相 比，T 细 胞I F N-γ 和T N F-α 的分泌水平没有显著变化［IFN-γ：（894.90±8.83）pg/mLvs（649.60±64.70）pg/mL，P＞0.05；TNF-α：（419.80±8.81）pg/mLvs（401.60±25.80）pg/mL，P＞0.05］，而4种不同SP的CD19-CAR-T中IFN-γ和TNF-α的分泌水平在阳性靶细胞组中显著升高（图5）。在阳性靶细胞组中，SP4-CD19细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平比SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19细胞和T细胞显著升高［IFN-γ：（5 819.00±281.90）pg/mLvs（2 626.00±154.50）pg/mL、（3 089.00±173.50）pg/mL、（3 844±39.08）pg/mL、（894.90±8.83）pg/mL，P＜0.01；TNF-α：（5 004.00±169.50）pg/mLvs（3 014.00±85.20）pg/mL、（3 351.00±66.43）pg/mL、（3 922.00±63.38）pg/mL和（419.80±8.81）pg/mL，P＜0.01］。

图5 4种CD19-CAR-T IFN-γ和TNF-α分泌水平Fig.5 The secretion levels of IFN-γ and TNF-α among four CD19-CAR T

3 讨论

ALL是淋巴细胞在分化早期恶性增殖造成的，可侵犯骨髓、血液和髓外部位，发病率高，预后和生存率不理想［17-18］。CAR-T免疫治疗能靶向性地杀伤具有特异性抗原的ALL细胞，而对正常细胞无杀伤作用，这将大大降低脱靶效应，为ALL的临床治疗提供新的策略。有研究［19-20］表明，增加CAR在T细胞表面的表达可以增加CAR-T的抗肿瘤能力，这为治疗ALL提供了一个全新的方案。本实验成功构建了表达不同SP的CD19-CAR分子的T细胞，并在体外验证出其具有靶向特异性，CD19抗原CAR对CD19＋ALL细胞有较为明显的杀伤作用，并且SP4-CD19细胞的转染效率和对CD19＋ALL细胞的杀伤作用明显高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞。该研究结果为CAR-T在临床转化中的优化方案提供了重要的实验依据。

近年来，靶向CD19的CAR-T在白血病的治疗中取得了重大突破［21-22］，关于CAR结构的胞内域改造方面的研究也越来越深入，而对scFv的N端SP研究较少。CAR的主要结构包括抗原结合区（包含SP）、铰链区、跨膜区和细胞内信号区［23］。这些元件都有各自独特的功能，可以通过使用来源于各种蛋白的结构域组合，来优化CAR的结构。因此，为了增强CAR结构在T细胞表面的表达及杀伤作用，本研究主要采用由单链抗体scFv、CD28跨膜区、CD28细胞内结构域、细胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链组成的第三代CAR的结构，并在此基础上优化了抗原结合区SP结构，从而增强对靶细胞的杀伤。从细胞毒性实验结果可以看出，携带不同SP的SP-CD19 CAR-T对CD19＋ALL细胞表现出特异性的杀伤效果，由此可以证明，不同的SP能够影响CAR在T细胞表面的表达以及对靶细胞的杀伤。

从研究结果可以看出，SP4-CD19细胞较其他SP的SP-CD19细胞对CD19＋ALL细胞杀瘤效应显著增强。ELISA法检测IFN-γ和TNF-α分泌水平结果显示，在CD19＋肿瘤细胞刺激下SP4-CD19细胞较其他SP的SP-CD19细胞IFN-γ和TNF-α分泌水平显著提高。研究表明，改造SP是一种有效增加重组蛋白表达量的方式［24］，并且SP具有极强的异质性，许多SP即使在不同物种之间也具有功能上的互换性［25］。这可能与CAR结构中的SP与SRP（信号识别颗粒）的识别有关，据推测，不同的SP对SRP表现出不同的亲和力，SRP随后决定了新生多肽链进入分泌途径的效率［26-27］。本研究发现，SP4-CD19细胞的转染效率和对靶细胞的杀伤力较其他3个SP均显著升高，这可能与SP4结合SRP的效率有关，其中的分子机制及作用效应还有待进一步实验验证。

综上所述，随着国内外科学家们对免疫疗法的深入研究，越来越多的研究者关注CAR-T对肿瘤细胞的杀伤作用［28］。本研究制备了含不同SP的CAR-T，并通过系统的体外实验初步验证了SP对提升CAR在T细胞表面表达的影响。从本实验中CAR-T对靶细胞的体外功能鉴定结果来看，SP4-CD19细胞较其他SP的CAR-T对靶细胞的杀伤和细胞因子分泌水平显著提高。这将为ALL的临床精准治疗提供参考，但是还需要通过动物实验评估其安全性。

利益冲突声明：所有作者均不存在利益冲突。