层析填料中顽固色素去除的新方法研究

翁志兵，王鹏红，赵 力，夏 松，金 坚，朱祯平，李华钟

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.三生国健药业（上海）股份有限公司，上海 201210）

随着抗体药物的快速上市，相似品种间的竞争日趋激烈。药监局医保政策与时俱进，集采步伐日益临近，抗体药物的价格呈现断崖式下跌趋势，促使抗体药物为主体的新型疗法成为惠及普通病患的治疗方法之一[1-4]。但是单克隆抗体的产业链发展并不完善，核心技术和关键材料大都被欧美企业垄断，直接导致抗体药的生产成本居高不下，高昂的生产成本与低廉的销售价格之间的矛盾凸显。药企在降低抗体的生产成本和优化抗体质量的两方面的需求已成为企业发展的核心[5-11]。基于目前市场及其技术发展的预期，抗体药物的成本将会从目前每克2 000美元降至每克200美元以下[12]才能惠及更多的患者。

在生物医药的各个生产阶段，纯化成本占整体生产成本的比例高达50%~80%[13]。其中层析介质的成本又在整个纯化工段中有着举足轻重的地位。延长层析介质的使用寿命可以显著降低生产成本，而在纯化生产过程中，层析介质可以有效去除上清液中多种杂质，如宿主蛋白质、内毒素、亲和填料脱落的Pro-A、色素等[14-15]。目前蛋白质中间体及原液中的宿主蛋白质、内毒素和残留的Pro-A蛋白质都有特定的方法精确检测，吸附在填料中的杂质也可以通过氢氧化钠、高盐再生等方式最大限度去除，以免污染最终产品[16]。但是不管是填料还是蛋白质中间体中的色素去除依然是一个重大技术难题。据文献报道，色素广泛存在于蛋白质中间体和最终原液中，具体表现为蛋白质中间体和原液呈现不同的颜色，尤其在高浓度蛋白质溶液中尤为显著[17]，如：铁离子形成的黄色、黄褐色[18]，维生素B12形成的粉色[19]以及镍离子形成的蓝色，其中以黄褐色最为普遍[20-21]。这些元素主要来自培养基和中间体所接触到的铁质工艺设备[22]，如不锈钢容器及管道；色素污染层析介质的具体表现是含有色素的中间体在层析系统上样过程中，色素会首先与层析柱上层填料结合，导致层析填料由乳白色变成色素相应的颜色，随着上样量和填料循环数的增加，色素会逐步扩散到中下层填料，严重时色素等杂质带来的污染能让层析柱内的填料塌陷。通常情况下，这些填料吸附的色素会被后续再生工序中的再生液去除，从而恢复填料性能，也避免吸附在填料上的杂质污染下一个工艺循环，将蛋白质原液的杂质残留降至最低，从而减淡蛋白质中间体的颜色，实现更好的原液质量。但在某些特殊情况下，我们发现用常规的方法无法去除填料中的色素，积累的色素将导致填料的使用寿命降低，具体表现是填料载量明显下降，填料外观颜色变深。

作者研究了Capto adhere ImpRes中顽固色素去除的案例，Capto adhere ImpRes是一款将配体N-苯甲基N-甲基乙醇胺耦合到活化的粒径约40μm的琼脂糖微球的阴离子交换填料，化学结构示意图见图1。

图1 Capto adhere ImpRes化学结构示意Fig.1 Diagram of chemical structure of Capto adhere ImpRes

抗体蛋白中间体使用Capto adhere ImpRes上样、平衡、洗脱，蛋白质样品和Capto adhere ImpRes填料均没有出现显著的颜色变化，但纯化结束后，用1 mol/L NaOH对该填料进行消毒再生时，发现上层填料的颜色由乳白色变成黄色，且随着循环次数的增加逐渐加深，最终呈现黄褐色，常规方法处理后填料无法恢复原本的乳白色。基于该类情况，如何开发一种有效去除层析填料色素来延长层析介质的寿命的方法尤为必要。本研究对这类极难去除的色素进行初步的研究，并达到良好的去除效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠，磷酸，氢氧化钠：国药控股化学试剂有限公司产品；醋酸，盐酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠：广州化学试剂厂产品；Tris：美国Promega公司产品；填料Capto adhere Impres：美国Cytiva公司产品；水：实验室超纯水；所有流动相均经过0.45μm滤膜过滤。

磷酸溶液：分别取0.1、0.3、0.5 mol的浓磷酸于烧杯中，加入超纯水搅拌均匀定容至1 L，配制成0.1、0.3、0.5 mol/L磷酸溶液。

平衡液：取1.21 g Tris和8.77 g NaCl置于烧杯中，加入超纯水搅拌均匀定容至1 L，经0.45μm滤膜过滤，制成10 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl，常温保存。

洗脱液：取0.050 mol醋酸置于烧杯中，加入超纯水搅拌均匀，定容至1 L，经0.45μm滤膜过滤，制成50 mmol/L醋酸，常温保存。

再生液：取26.08 g Na2HPO4·2H2O和14.28 g Na2HPO4·12H2O置于烧杯中，加入超纯水搅拌均匀，定容至1 L，经0.45μm滤膜过滤，制成200 mmol/L PB，常温保存。

消毒液：取20 g NaOH置于烧杯中，加入超纯水搅拌均匀定容至1 L，经0.45μm滤膜过滤，制成0.50 mol/L NaOH，常温保存。

保存液：取0.4 g NaOH置于烧杯中，加入超纯水搅拌均匀定容至1 L，经0.45μm滤膜过滤，制成0.01 mol/L NaOH常温保存。

1.2 仪器与设备

AKTA pure m150：美国Cytiva公司产品；pH计、电导仪：瑞士梅特勒-托利多公司产品；NanoDROP 2000型分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific公司产品；电感耦合等离子体质谱ICPMS 7900：美国Agilent公司产品；电子天平：德国Sartorius公司产品；纯水仪：德国Merck公司产品；Centrifuge 5910R冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 填料孵育方法将不同浓度磷酸溶液分别加入到含有色素的Capto adhere Impres，室温振荡处理并分别离心5、10、15 min。处理后的填料经振荡混匀，用1 mol/L NaOH调pH至中性。

1.3.2 Capto adhere ImpRes的动态载量测试方法将上述处理后的Capto adhere ImpRes按照如下步骤进行处理：首先对柱子进行前处理，依次加入超纯水3 cv（cv代表柱体积，3 cv即3个柱体积），消毒液3 cv，超纯水3 cv，再生液3 cv，超纯水3 cv，平衡液3 cv；然后进行上样；最后对柱子进行后处理，依次加入平衡液6 cv，洗脱液5 cv，消毒液3 cv，超纯水3 cv，保存液3 cv。各溶液配方见表1。

表1 不同溶液的配方Table 1 Formulations of different solutions

1.3.3 铁离子测量方法利用电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）分析检测蛋白质样品中的Fe离子的浓度，将0.2 mL样品溶液准确地转移到15 mL离心管中，用2 g/dL硝酸溶液稀释至2 mL，充分混合并于12 000 r/min离心10 min，取上清液进行检测。ICPMS法检测的仪器参数设定为：RF射频功率1 550 W，蠕动泵转速0.1 r/s，采样速度0.3 r/s，样品采样时间为60 s，稳定时间40 s，采样深度8 mm，辅助气体（高纯氩气）流量1.0 L/min，载气（高纯氩气）流量为1.14 L/min。

2 结果与分析

2.1 不同种类浓度酸溶液处理结果

分别使用17.5 mol/L醋酸、14.63 mol/L磷酸、1 mol/L柠檬酸和12 mol/L盐酸加入到含有色素的Capto adhere Impres中，室温振荡处理5 min，观察填料颜色变化。由图2可知，浓磷酸去除填料色素的能力高于柠檬酸，上清液呈黄色；浓醋酸和浓盐酸不能明显去除填料色素，因此后续实验选用磷酸去除填料色素。

图2 不同浓度酸处理后的Capto adhere ImpresFig.2 Capto adhere Impres after treatment with different concentrated acids

2.2 不同浓度磷酸溶液孵育结果

使用不同浓度的磷酸溶液加入含有色素的Capto adhere Impres里，室温振荡5、10、15 min，取上清液离心，测铁离子质量浓度，孵育后的填料用1 mol/L NaOH调pH至中性，沉降分层。由表2可知，0.5 mol/L磷酸处理填料5 min时，上清液中铁离子浓度最高，去除色素能力最强。色素去除后对各组填料载量性能进行测试，0.5 mol/L磷酸处理时间为10~15 min后的载量恢复到填料初始状态（载量约76 mg/mL）。

由表2和图3可知，相同磷酸浓度下，孵育最初10 min，载量随时间增长快速增加，10 min后增长变缓，而铁离子质量浓度却逐渐降低，推断在磷酸处理填料过程中，铁离子可能与填料基架的多孔结构发生二次吸附，因而铁离子质量浓度随时间呈下降趋势。二次吸附的铁离子预计在下次NaOH消毒处理填料时再次产生色素，因此需要控制孵育时间；在相同孵育时间的条件下，随着磷酸浓度的增加，铁离子质量浓度和载量同时增加。综上所述，磷酸浓度和孵育时间对去除填料色素及恢复载量有重要影响。

表2 不同浓度磷酸处理不同时间的Capto adhere ImpresTable 2 Capto adhere Impres treated with different concentrations of phosphoric acid for different time

图3 不同浓度磷酸处理不同时间的Capto adhere ImpressFig.3 Capto adhere Impress treated with different concentrations of phosphoric acid for different time

使用不同浓度磷酸和不同的孵育时间对Capto adhere Impress进行响应面分析，将表2数据导入到JMP软件中，以磷酸浓度和孵育时间为输入值，铁离子质量浓度和载量为响应输出，进而得到图4。由图4可知，蓝色线为75 mg/mL载量等高线，红色线为20μg/mL铁离子质量浓度等高线，白色区为推荐工艺操作面。填料对照组载量为75.86 mg/mL，以76 mg/mL载量为实验目标，选择0.5 mol/L磷酸孵育填料8.75~11.35 min就可以实现以上目的。

图4 响应面分析法Fig.4 Response Surface Methodology

3 结 语

在本研究的阴离子填料案例中，在蛋白质上样、平衡、洗脱阶段，中间体样品和填料均没有出现显著的颜色变化，但在NaOH对填料进行消毒再生时，填料由乳白色逐渐变黄色，且随填料的循环次数增加，颜色逐渐加深，最终呈黄褐色，推测填料中吸附的铁离子与氢氧化钠发生反应，产生黄色沉淀颗粒，并沉积滞留于填料多孔腔内部，反应如下：

随着酸的加入，Fe（OH）3沉淀逐步溶解，释放铁离子到酸溶液中，酸溶液颜色逐渐变黄。当铁离子到达一定质量浓度后，铁离子又与填料发生可逆吸附，使得溶液中的铁离子逐渐减少。可以预见，后期对填料再次进行NaOH消毒处理后，色素会继续产生。在填料色素去除能力方面，磷酸和柠檬酸效果大于盐酸和醋酸，推断是由于三价酸和铁离子结合力大于一价和二价酸，磷酸效果大于柠檬酸，推断强酸更利于结合铁离子，具体原因还有待进一步研究。作者通过对不同浓度磷酸处理不同时间的Capto adhere Impress中的色素研究，发现磷酸可以显著去除Capto adhere Impress的色素，并恢复填料寿命到最佳状态，同时最大程度降低填料中的杂质对蛋白质中间体影响，对使用相关填料的工业化生产降本增效产生积极影响。