大狼毒对紫花苜蓿种子萌发及幼苗生长的化感效应研究

李彦飞， 初晓辉， 李嘉懿， 马祖艳， 牛琼梅， 单贵莲*

(1.云南农业大学动物科学技术学院， 云南 昆明 650201；2.德州市庆云县自然资源局， 山东 德州 253700)

植物化感作用(Allelopathy)是指植物通过向环境释放特定的化学物质从而影响临近或后续同种或异种植物萌发和生长的效应[1]。植物会通过化感作用增强植物竞争能力、改变群落物种分布格局[2]。植物化感作用在草地植物群落格局的构建及群落演替过程中占据着重要的地位和作用[2-5]。化感作用会通过影响群落内其他物种的种子萌发和幼苗生长，进而改变群落中物种的分布格局[6-11]。如Li等研究表明，冷蒿(Artemisiafrigida)会对典型草原常见物种萌发和生长产生影响[7]。孙庚等研究表明，瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)花粉浸提液会显著降低与它同花期的其它物种的花粉萌发和种子结实[8]。鲍根生等指出，甘肃马先蒿(Pediculariskansuensis)浸提液对中华羊茅(Festucasinensis)、垂穗披碱草(Elymusnutans)等草原物种的种子萌发和幼苗生长具有显著的抑制作用[9]。张玉娟研究表明，星毛委陵菜(Potentillaacaulis)浸提液对冷蒿幼苗的生长表现出“低促高抑”的化感效应[10]，该物种具有的化感作用对促进其占据过度放牧草原的群落优势地位起到了关键的控制作用[11]。化感作用还被证明是群落演替的重要驱动力[4,12-13]。如Rice等指出，化感作用在俄克拉荷马草原群落演替过程中起着重要的作用，在群落演替的先锋阶段，杂草分泌的化学物质不仅会抑制土壤中固氮微生物的生长活性，造成土壤退化，也会产生自毒效应，从而影响群落演替进程[12]。邓文红研究表明，鄂尔多斯沙地的黑沙蒿(Artemisiaordosica)通过释放化感物质来影响共生植物的种子萌发和幼苗生长，从而影响和调节群落演替进程[13]。

大狼毒(Euphorbiajolkinii)属大戟科多年生毒害草型草本植物，分布于云南、台湾、四川等地[14]。该物种具有根系入土深，抗寒抗旱性强，对土壤养分，特别是对土壤磷竞争强等特性[15-16]，一般情况下，在适度放牧的草地，大狼毒在草地植物群落中以偶见种或伴生种存在，在放牧过度的退化草地，大狼毒常成片生长并逐渐取代优良牧草而成为群落中的优势物种[17-19]。在大狼毒种群集中分布区域，草地中物种数量锐减，群落中仅有大狼毒、西南委陵菜(Potentillafulgens)、绶草(Spiranthessinensis)、西南野古草(Arundinellahookeri)、三穗苔草(Carextristachya)等少数几个物种存在，且西南野古草、三穗苔草等优良牧草产量大幅度下降，大狼毒密度及生物量显著增加，大狼毒成为了群落的优势物种，草地基本失去其生产价值[19]。

大狼毒的扩散蔓延导致草地物种多样性显著下降的原因之一可能是化感作用。为探讨狼毒是否会对其它物种产生化感作用这一科学问题，本研究居于作者前期开展的滇西北高寒地区优良牧草适应性评价的研究结果[20]，并兼顾考虑供、受体材料生态位的重叠，选取根系入土深，抗寒抗旱性强，适宜用于滇西北高寒地区补播治理退化草地及建植人工草地的‘牧歌401+Z’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Amerigraze 401+Z’)为受体材料，开展大狼毒植株及其根部土壤对紫花苜蓿种子萌发、幼苗生长及生理的化感效应研究。通过本项研究，探讨大狼毒化感作用是否存在，揭示大狼毒蔓延区草地物种多样性锐减的原因，促进退化草地的恢复治理。

1 材料与方法

1.1 供试材料及获取方法

1.1.1大狼毒根、茎叶及根部土壤的获取 2019年8月中下旬大狼毒生长旺盛期，于云南省迪庆州香格里拉县挖取大狼毒完整植株，将盛花期大狼毒植株上的灰土刷净，分为根、茎叶2部分，带回实验室自然风干、粉碎、过筛(孔径0.45 mm)备用。同步采集大狼毒根部土壤(根部周围5 cm范围)，采集深度为0～20 cm，带回实验室风干备用。

1.1.2受体材料来源及品种特性 受体材料为北京正道种业有限公司提供的‘牧歌401+Z’紫花苜蓿。该品种原产地美国，具有产量高品质好、抗寒抗旱性强等特性，引种试验表明其在滇西北高寒地区适应性好，生产性能高，是当地建植人工草地及改良天然草地的优选品种[20]。

1.2 测定指标与方法

1.2.1种子萌发试验及测定指标 参照刘雅婧等[21]的方法，采用培养皿法开展种子萌发试验研究。具体为：分别称取大狼毒根、茎叶、根部土壤100 g，放入1 000 mL蒸馏水中，恒温震荡12 h后静置12 h，用定量滤纸和孔径为0.45 μm的滤膜二重过滤，得到100 g·L-1的浸提液母液，将该母液用蒸馏水稀释，分别获得浓度为25，50，75，100 g·L-1的浸提液[21]。浸提液放入4℃的冰箱中冷藏备用。

挑选饱满、无虫害的苜蓿种子置于浓度为2 %的次氯酸钠(NaClO)溶液中浸泡20 min，用自来水冲洗3次，纯净水冲洗2次。以培养皿为载体，每皿100粒苜蓿种子，在(25±1)℃下，14 h光照/10 h黑暗，光强 6 000 lx进行培养，研究添加蒸馏水(CK，设为对照)，25 g·L-1(C25)，50 g·L-1(C50)，75 g·L-1(C75)，100 g·L-1(C100)大狼毒根、茎叶、根部土壤对苜蓿种子发芽率和发芽势的影响。每浓度梯度设3次重复。一旦胚根出现则认为种子已经萌发。逐日观察记录发芽种子并补充蒸发的水分，使各处理液浓度维持不变。记数持续进行到经过3 d再无种子发芽，种子发芽结束后计算发芽率和发芽势[21]。

发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%

发芽势=(第4天发芽种子数/供试种子数)×100%

1.2.2幼苗生长试验及测定指标 模拟植物在自然条件下产生化感作用的状况，参考王慧等的方法[22]，采用穴盘法开展幼苗生长试验。在穴盘中添加不同用量的大狼毒粉碎物，通过大狼毒在土壤中缓慢腐解释放化感物质的方法，开展大狼毒对受体植物幼苗生长及生理化感效应的研究。具体为：分别称取0，1，2，3 g大狼毒根、茎叶、根部土壤放到体积为400 mL的穴盘中(编号为Y0，Y1，Y2，Y3，每用量设5次重复)与珍珠岩混合均匀，于2020年5月中旬播种(每重复播种50粒)，每隔一天浇一次水，每周浇一次Hoagland营养液，出苗后生长35 d左右待紫花苜蓿长到分枝期，测定单株鲜重、株高(垂直高度)、根长[23]。参考王学奎(2006)[24]的方法，测定幼苗的根系活力、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量及可溶性糖含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析、差异性检验及多重比较(Duncan法)，数据用平均值±标准误表示。用Muhammad等(2021)[25]的方法计算化感效应指数(Inhibitory rate，RI)，公式为RI= 1-C/T(T为处理组，C为对照组)，其中RI>0表现促进效应，RI<0表示抑制效应，绝对值大小代表化感效应强度。综合化感效应(Synthetical effect，SE)反应化感效应的强弱，用各处理的RI的均值来表示，公式为SE=(RI1+RI2+……+RIn)/n，SE<0表示抑制效应，SE>0表现促进效应，且SE绝对值大小表示化感效应作用强度，n是化感效应指数的个数[21]。

2 结果与分析

2.1 大狼毒对紫花苜蓿种子萌发的影响

发芽率高表示有生命的种子多。由图1(A)可知，与CK相比，低、中浓度(C25，C50)大狼毒根部土壤、根水浸提液对紫花苜蓿发芽率无显著影响；高浓度(C75，C100)大狼毒根部土壤、根水浸提液显著抑制了紫花苜蓿的发芽率(P<0.05)。低浓度(C25)大狼毒茎叶水浸提液对紫花苜蓿发芽率无显著影响，中、高浓度(C50，C75，C100)大狼毒茎叶水浸提液显著抑制了紫花苜蓿的发芽率(P<0.05)，发芽率分别比CK降低了8.1%，13.7%和25.6%。

发芽势高表示种子的生活力强，发芽出苗整齐一致[14]。如图1(B)所示，与CK相比，低浓度(C25)大狼毒根部土壤、茎叶、根水浸提液对紫花苜蓿的发芽势有一定的促进效果，但促进效果均不显著；中、高浓度(C50，C75，C100)大狼毒根部土壤、茎叶、根水浸提液会导致紫花苜蓿发芽势的显著下降(P<0.05)。

图1 大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发的影响Fig.1 Effects of extracts from E. jolkinii on alfalfa seed germination注：不同小写字母表示大狼毒同一部位不同浓度对紫花苜蓿种子萌发的影响有显著差异(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate that different concentrations of the same treatment have significant difference at the 0.05 level

由图2可知，低浓度(C25)大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发的综合化感效应为正值，即低浓度大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发有一定的促进作用；中、高浓度(C50，C75，C100)大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发的综合化感效应均为负值，即高浓度大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发有抑制作用，且随浸提液用量的增加抑制作用增强。不同部位大狼毒浸提液的综合化感效应强弱顺序为：根>茎叶>根部土壤。

图2 大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发的综合化感效应Fig.2 Allelopathic effects of E. jolkinii extracts on alfalfa seed germination

2.2 大狼毒对紫花苜蓿幼苗生长的影响

由图3(A)可知，添加大狼毒根、茎叶粉碎物后，紫花苜蓿株高总体呈下降趋势，与CK相比差异显著(P<0.05)；低用量(Y1)大狼毒根部土壤促进紫花苜蓿的生长，与CK相比株高显著增加，中、高用量(Y2，Y3)大狼毒根部土壤对紫花苜蓿株高无显著影响，与CK相比株高无显著变化。由图3(B)可知，与CK相比，添加大狼毒根部土壤对紫花苜蓿根的生长有一定的促进作用，但促进效果不显著；添加大狼毒茎叶、根粉碎物对紫花苜蓿根的生长有显著的抑制作用(P<0.05)，且抑制作用随大狼毒用量的增加而加强。由图3(C)可以看出，添加大狼毒根部土壤对紫花苜蓿单株鲜重无显著影响；添加大狼毒茎叶、根粉碎物会显著抑制紫花苜蓿地上部的生长，显著降低其地上部单株鲜重(P<0.05)，且其抑制作用随大狼毒添加量的增加而加强。与CK相比，高用量(Y3)大狼毒茎叶、根粉碎物处理下，紫花苜蓿地上部单株鲜重分别下降了59.4%和65.7%。

图3 大狼毒对紫花苜蓿幼苗生长的影响Fig.3 Effects of E. jolkinii on alfalfa seedling growth注：不同小写字母表示大狼毒同一部位不同用量对紫花苜蓿幼苗生长的影响有显著差异(P<0.05)，下图同Note:Different lowercase letters indicate that different concentrations of the same treatment have significant difference at the 0.05 level,the same as below

由图4所示，大狼毒根部土壤、根、茎叶对紫花苜蓿幼苗生长的综合化感效应强弱顺序为：根>茎叶>根部土壤。具体体现为：低用量(Y1)大狼毒根部土壤对紫花苜蓿幼苗生长有一定的促进作用，原因可能是大狼毒根部土壤含有较高的C，N，P等营养物质[15]，因此促进了紫花苜蓿的生长。中、高用量(Y2，Y3)大狼毒根部土壤对紫花苜蓿幼苗生长无显著影响，原因可能是随着添加量的增加，土壤中化感物质含量增加，化感作用增强，化感产生的抑制作用和养分增加带来的促进作用相抵消，因此对紫花苜蓿幼苗生长表现为无显著影响。大狼毒茎叶、根粉碎物在腐解过程中均对紫花苜蓿幼苗生长有抑制作用，且抑制效果随大狼毒用量的增加而增强，分析原因为大狼毒植株体内含有二萜、三萜类、苯丙素类等化学物质[26]，这些化学物质会抑制受体植物的生长，且随着粉碎物用量的增加，抑制作用增强。

图4 大狼毒对紫花苜蓿幼苗生长的综合化感效应Fig.4 Allelopathic effects of E. jolkinii on alfalfa seedling growth

2.3 大狼毒对紫花苜蓿幼苗生理的影响

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生会加剧细胞膜的损伤。如图5(A)所示，添加大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿幼苗体内MDA含量显著降低，与CK相比差异显著(P<0.05)。添加大狼毒茎叶和根粉碎物处理后，紫花苜蓿MDA含量均显著增加，与CK相比差异显著(P<0.05)(Y1根处理除外)，且增加幅度随大狼毒茎叶和根粉碎物添加量的增加而增加。

可溶性糖可通过调节渗透压来抵抗胁迫损伤，进而对细胞起到保护作用。如图5(B)所示，添加大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿可溶性糖含量显著升高(P<0.05)，Y1，Y2，Y3根部土壤处理下，紫花苜蓿可溶性糖含量分别是CK的2.3，2.4和2.2倍。添加大狼毒茎叶和根粉碎物处理后，紫花苜蓿可溶性糖含量显著下降(P<0.05)(Y1根处理除外)，且下降幅度随大狼毒茎叶和根粉碎物添加量的增加而增加。具体为：与CK相比，Y1，Y2，Y3茎叶处理下，紫花苜蓿可溶性糖分别降低21.2%，51.4%和66.6%；Y1，Y2，Y3根处理下，紫花苜蓿可溶性糖含量分别降低38.2%，70.8%和77.7%。

根系活力对植物体的生长至关重要，其水平直接影响植物体的生长情况。如图5(C)所示，添加大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿根系活力显著增强，与CK相比差异显著(P<0.05)。添加大狼毒茎叶和根粉碎物处理后，紫花苜蓿根系活力下降，与CK相比差异显著(P<0.05)(Y1茎叶处理除外)，且下降幅度随大狼毒粉碎物用量的增加而增加。与CK相比，Y1，Y2，Y3茎叶处理下，紫花苜蓿根系活力分别下降0.9%，14.7%和21.2%。Y1，Y2，Y3根处理下，紫花苜蓿根系活力分别下降35.7%，41.0%和44.3%。

由图6可知，大狼毒根部土壤对紫花苜蓿幼苗生理的综合化感效应为正值，即根部土壤对紫花苜蓿的生长有促进作用；大狼毒茎叶和根粉碎物在腐解过程中对紫花苜蓿的综合化感效应为负值，即大狼毒茎叶和根粉碎物在腐解过程中对紫花苜蓿的生长产生抑制作用，抑制作用强度随粉碎物用量的增加而增强。大狼毒根部土壤、根、茎叶对紫花苜蓿幼苗生理的综合化感效应强弱顺序为：根>茎叶>根部土壤。

3 讨论

植物间的化感作用主要体现在对受试植物种子萌发和幼苗生长的影响。针对毒害草对植物种子萌发的影响，前人研究表明，毒害草对植物种子的萌发基本表现为“低促高抑”，且抑制强度随化感物质浓度的增加而加强[9,21-22,27-29]。毒害草所含有的萜类物质会干扰线粒体发挥正常功能，妨碍代谢过程并可抑制细胞分裂伸长，使细胞分化减少，矿质离子吸收受阻，组织出现紊乱，从而抑制种子的发芽和生长[29-30]。本研究结果表明，大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发的影响表现为“低浓度促进高浓度抑制”，但促进效果不显著。不同部位大狼毒水浸提液对紫花苜蓿种子萌发的作用强度有差异，体现为根>茎叶>根部土壤。高浓度大狼毒浸提液推迟了紫花苜蓿种子的萌发时间，降低其最终发芽率，推测可能是大狼毒水浸提液中化学物质使紫花苜蓿种子的细胞活动受到了影响，种子正常的生理代谢活动发生异常，种子萌发的生理过程延期并影响了发芽率，但化感物质的种类还有待进一步研究。

幼苗生长对于植物整个生活至关重要，植物在幼苗阶段向外界充分吸收营养物质供植物体生存和繁衍。刘雅婧等研究表明，狼毒浸提液处理下紫花苜蓿、垂穗披碱草(Elymusnutans)、冰草(Agropyroncristatum)幼苗生长均受到抑制，且抑制作用随狼毒浸提液浓度的增加而增强[21]。刘利红研究表明，不同质量浓度狼毒根、茎叶水浸液处理对5种受体植物各项形态指标具有促进和抑制的双重作用，其化感效应指数体现为随浓度升高而降低[30]。本研究模拟自然界中残株腐解的化感作用方式开展大狼毒对紫花苜蓿幼苗生长的影响研究，结果表明大狼毒根部土壤对紫花苜蓿幼苗形态指标综合化感效应为正值，即为促进作用，但促进效果不显著。原因可能是由于大狼毒的“肥岛效益”使根部土壤中富集了更多的C，N，P[15,18]，大狼毒根部土壤的添加使苜蓿生长环境中土壤养分含量增加，因此体现为根部土壤的添加促进了紫花苜蓿幼苗的生长，但此结论还需进一步的深入研究。大狼毒根、茎叶水浸液对幼苗形态指标的影响为负值，即抑制作用，且随粉碎物用量的升高抑制作用增强，原因是大狼毒水浸提液中化学物质使紫花苜蓿幼苗生理活动受到了影响，进而影响其生长。

关于毒害草对植物生理指标的影响，马银山等研究表明，不同浓度的天仙子(Hyoscyamusniger)种子浸提液处理下，多年生黑麦草(Loliumperenne)幼苗MDA含量随浸提液浓度的增加而增加[29]。李翔研究表明黄花棘豆(Oxytropisochrocephala)水提液处理降低了燕麦(Avenasativa)幼苗的可溶性糖及根系活力，提高了MDA含量，且对受体根的化感作用强于对茎叶[31]；富瑶研究表明瑞香狼毒提取液使荩草(Arthraxonhispidus)幼苗可溶性糖含量降低，MDA含量升高[32]。本研究表明，大狼毒茎叶、根粉碎物在腐解过程中使受体植物紫花苜蓿可溶性糖含量和根系活力降低，MDA含量增加。大狼毒体内所含化学物质首先作用于紫花苜蓿的根并对其膜透性产生影响，对根系活力的抑制作用导致紫花苜蓿对生长所需的水分、养分吸收运转过程受阻，导致紫花苜蓿正常的生理代谢异常，幼苗组织内淀粉酶活力下降，淀粉难于水解为可溶性糖，致使幼苗生长能源缺乏，不能进一步转化为氨基酸形成蛋白质，从而抑制紫花苜蓿生长。大狼毒根部土壤处理对紫花苜蓿生理指标的影响与对形态指标的影响表现出相似的结果，即大狼毒根部土壤的添加使苜蓿生长环境中土壤养分含量增加[15,18]，肥力的增加一定程度上提高了紫花苜蓿幼苗可溶性糖含量及根系活力，降低其MDA含量，促进了紫花苜蓿幼苗的生长。

综上所述，大狼毒的化感作用真实存在，化感作用是导致大狼毒种群蔓延区草地物种多样性锐减的主要原因之一。针对大狼毒型退化草地的补播治理，不仅要考虑补播材料对当地的气候适应性，还应该考虑补播材料对大狼毒的化感适应性。今后，应深入开展目前广泛用于滇西北退化高寒草地补播治理的白三叶(Trifoliumrepens)、红三叶(Trifoliumpratense)、多年生黑麦草、鸭茅(Dactylisglomerata)、紫花苜蓿等优良牧草对大狼毒化感适应性的比较研究，筛选出对大狼毒化感作用不敏感的优良牧草，促进滇西北大狼毒蔓延区退化草地的恢复治理及草地畜牧业的健康发展。另外，本研究主要针对大狼毒对紫花苜蓿种子萌发和幼苗生长展开试验，得到不同浓度及不同部位大狼毒浸提液对紫花苜蓿种子萌发的化感作用强度，以及不同用量及不同部位大狼毒粉碎物对紫花苜蓿幼苗生长的化感作用强度，但对于大狼毒化感物质的成分，以及大狼毒根部土壤促进牧草幼苗生长的结论，还需要进一步以其他牧草为受体材料，开展深入研究。

4 结论

大狼毒水浸提液对紫花苜蓿种子萌发率和萌发进程体现为“化感抑制”作用，且抑制作用随浸提液浓度的增加而增强。大狼毒植株粉碎物在腐解过程中会导致紫花苜蓿根系活力和可溶性糖含量降低，MDA含量升高，进而显著抑制紫花苜蓿幼苗的生长(P<0.05)，大狼毒根部土壤对紫花苜蓿幼苗生长有一定的促进作用，但促进效果不显著。大狼毒根、茎叶、根部土壤对紫花苜蓿萌发生长的综合化感效应强弱顺序为：根>茎叶>根部土壤。