一株Cr（Ⅵ）抗性菌株的筛选鉴定及铬还原特性研究

陈炜婷 邓伟 李海涛 陈洁 胡慧娜

（国家海洋局南海环境监测中心/海南南沙珊瑚礁生态系统国家野外科学观测研究站 广东广州 510300）

目前，随着全球工业化进程的不断加速，来自于矿山（排水）、化工、制酸、冶金及金属表面酸性处理、电镀、染料等行业产生的含重金属离子废水是工业废水中最常见、危害程度最高的一种废水，其特征是含有大量可溶性重金属离子。重金属离子不经处理排入水体，会使受纳水体酸化，产生潜在的腐蚀性，其中的重金属如铅、铜、锌、铬等可通过食物链积累，导致人体慢性中毒［1-5］。地下水中铬含量为0.008 μmol/L～173 μmol/L，海底沉积物和土壤中铬的含量为98 nmol/L～76 mmol/L，是第二大重金属污染［6］。Cr（Ⅵ）的高可溶性及强流动性导致其污染源很难被追踪，易污染水源。因此，处理含铬废水的研究关系到人类健康和生态环境，是含重金属废水处理中十分急迫的任务之一。

传统的含重金属离子废水处理方法，如化学沉淀法、离子交换法、吸附法、电解法和氧化还原法等往往存在处理费用高、易导致二次污染等诸多缺点。微生物作为一种新兴的处理技术，具有成本低、适用性强及无二次污染等优点，已受到国内外环境工作者的广泛关注［7］。

芽孢杆菌，是一类能够形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌，包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌属和梭菌属等。芽孢杆菌可存在于空气、水体等环境中，对外界有害因子具有较强的抗性［8］。

本研究从台山广海湾惰性拆建物料处置区海洋沉积物中分离得到一株Cr（VI）抗性菌Y1，通过菌落形态、革兰氏染色以及16S rRNA 基因序列系统发育分析，鉴定了该菌株。本研究还分析了该菌株的生长曲线，探讨了不同pH、温度和盐度条件下该菌生长的最适环境条件，研究了不同初始铬浓度下该菌的Cr（VI）还原特性。本研究为Cr（VI）污染环境治理提供了微生物的菌种资源和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本项目选取广东台山广海湾作为研究海区。沉积物样品于2018 年10 月采于台山广海湾惰性拆建物料处置区GH7 站点E112°50.000′，N21°54.000′。采用抓斗式采泥器采集表层0 cm～5 cm 处沉积物样品，将样品装入聚乙烯袋中，用海水覆盖，保存于-20 ℃中。样品在超净台内切除表层，取内层沉积物进行下一步实验以避免污染。

培养基成分及分量［9］为：2216E液体培养基：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，磷酸铁微量，人工海水1 000 mL；LB 液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 1 g，蒸馏水1 000 mL。2216E 和LB 固体培养基分别在上述的液体培养基中加入20 g琼脂。

1.2 菌株的分离纯化、筛选

在带有玻璃珠的100 mL 已灭菌的人工海水中加入10 g沉积物样品，置于35 ℃，180 r/min 摇床中24 h，充分打散混匀。取1 mL 悬浊液分别以10-1～10-5浓度稀释均匀涂布于2216E 培养基平板上，置于35 ℃培养数天。通过观察菌落的形态和大小，将不同形态或大小的菌通过平板划线的方法来进行分离纯化。制备含有25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 铬Cr（VI）的固体2216E 培养基，利用平板划线的方法依次把纯化后的不同菌落接种到含铬Cr（VI）固体2216E 培养基中，仔细观察菌株的长势和大小，把长势良好、活性高的菌株挑取出来，淘汰活性低的菌种，从而筛选出Cr（VI）还原菌株Y1。

1.3 菌株鉴定

将所得Y1 菌株接种于LB 培养基内，35 ℃、180 r/min 摇床培养，稀释菌液涂布平皿，培养24 h 后按照《微生物学实验》［10］进行革兰氏染色；Y1 菌株总DNA 利用细菌DNA 提取试剂盒提取，选取16S rRNA 通用引物27F 和1492R 进行PCR 扩展，PCR 产物利用回收试剂盒纯化后，由广州艾基生物技术有限公司测序。将测序得到的16S rRNA 序列在NCBI 数据库上进行BLAST 序列比对分析，利用软件MEGA 7.0 构建16S rRNA系统发育树。

1.4 菌株的生长特性研究

（1）生长曲线的测定。将筛选出来的耐铬优势菌株按1∶100接种比例接种到液体2216E 培养基，28 ℃，180 r/min 恒温振荡培养，每间隔2 h 取样品测定OD600值，绘制生长曲线。

（2）pH 值对菌株生长的影响。将筛选出来的耐铬优势菌株分别置于6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 不同pH 值下的液体2216E培养基中，振荡培养48 h 后取样，测定OD600值。

（3）温度对菌株生长的影响。将筛选出来的耐铬优势菌株分别置于27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃不同温度下的液体2216E 培养基中，振荡培养48 h 后取样，测定OD600值。

（4）盐度对菌株生长的影响。将筛选出来的耐铬优势菌株分别置于5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L 不同NaCl 浓度下的液体2216E 培养基中，震荡培养，每隔12 h 取样测定OD600值，培养周期为96 h，在不同NaCl 浓度下测定该菌株对50 mg/L的Cr（VI）还原趋势。

1.5 菌株的Cr（VI）还原特性

将Y1 菌株接种到2216E 液体培养液中，置于培养箱中35 ℃培养，培养至对数期后，将菌液以5%的接种量加入到不同Cr（VI）浓度（25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L 和400 mg/L）的2216E 液体培养基中。不定时用灭菌的针筒分别抽取上述菌液10 mL 于洁净离心管中。把离心管置于离心机中高速离心分离，后测定上清液OD540处Cr（VI）的浓度。

2 实验结果及分析

2.1 菌株的分离纯化、筛选及鉴定

通过富集纯化，在含有100mg/L 铬Cr（VI）的固体培养基上获得菌株Y1。在固体培养基上，该菌株的菌落为圆形，菌落表面不光滑有皱褶，边缘整齐（见图1）。从革兰氏染色镜检情况来看，Y1 菌株的细胞形状是杆状，染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌。

图1 优势菌株Y1 培养特征

将菌株Y1 测序后的16S rRNA 序列在NCBI 上进行BLAST 比对，构建系统发育树（见图2），结果显示该菌株与Bacillus aerius strain 24K、Bacillus stratosphericus stain 41KF2a等菌株的同源性达100.0%。

图2 系统发育树

根据该菌株的菌落形态、革兰氏染色和16S rRNA 基因序列分析可确定菌种为Bacillus（芽孢杆菌属）。

2.2 生长曲线测定结果

使用光电比浊法［11］测定菌株Y1 生长曲线（见图3）。由图3 可知，0 h～8 h 菌株Y1 处于生长调整期，8 h～22 h 为对数生长期，生长速度明显加快，特别是8 h～10 h 之间，菌体生长最快，22 h 后菌株进入生长稳定期和衰亡期。

图3 菌株Y1 的生长曲线

2.3 pH 值对菌株生长的影响

pH 值对菌株生长的影响大多是以控制培养基的初始pH值来进行。发酵过程中，菌株的生长速度会受pH 值的变化而变化，菌株的代谢途径及细胞结构亦会受到影响，不合适的发酵液pH 值会导致菌株生长速度减慢［12］。过高的pH 值会影响蛋白酶电离率，损害蛋白酶的功能，从而影响菌株的活性［13］。起始pH 值对菌株Y1 生长的影响曲线见图4。由图4 可知，菌株Y1 的最适pH 值为7.5。

图4 起始pH 值对菌株Y1 生长的影响

2.4 温度对菌株生长的影响

温度对菌株Y1 生长的影响曲线见图5。由图5 可知，在25 ℃～35 ℃时，随着温度的升高，OD600升高。当温度为35 ℃时的OD600最大。在35 ℃～40 ℃时，OD600随着温度的升高而下降，并在40 ℃时降为最低，因此菌株Y1 的最适生长温度为35 ℃。

图5 温度对菌株Y1 生长的影响

由于微生物去除Cr（VI）的机理是酶促反应，过低温度下细胞膜流动性的减弱会阻碍运输系统的正常运行，导致基质不能进入细菌细胞内，从而抑制其正常生长；过高温度则会使蛋白质发生不可逆的变性，从而使去除Cr（VI）的蛋白酶功能受到损伤，影响蛋白合成机制或改变细胞膜的结构［14］。

2.5 NaCl 盐浓度对菌株生长的影响

NaCl 浓度会影响菌株对环境渗透压的耐受程度，从而影响菌株的生长［15］。在稳定渗透压溶液中菌株细胞内含水量稳定，菌株生长最好［16］。盐浓度过低或过高，会使菌体因失水或水分过多胀破而导致菌量下降。不同NaCl 盐浓度对菌株Y1生长的影响曲线见图6。由图6 可知，随着NaCl 浓度的增加，菌株Y1 的生长相应受到抑制，但也可耐受高盐环境。杨宇等［17］利用筛选出来的芽孢杆菌G12 菌株在不同NaCl 浓度下对Cr（VI）的还原实验中，菌株在20 g/L NaCl 浓度下和25 g/L NaCl 浓度下对Cr（VI）的还原率分别为60%和40%，虽然高盐浓度抑制了菌株对Cr（VI）的还原能力，但菌株G12 也可耐受高盐环境。

图6 不同NaCl 盐浓度对菌株Y1 生长的影响

2.6 不同初始Cr（VI）浓度下菌株的还原特性

在菌株生长过程中，其生长及其对Cr（VI）的去除效率会受到Cr（VI）浓度变化的影响。菌体对Cr（VI）的还原时间因为Cr（VI）浓度的升高而相对延长，Cr（VI）还原效率降低［17］。不同初始Cr（VI）浓度下菌株Y1 的还原特性曲线见图7。由图7 可知，在浓度为25 mg/L～200 mg/L 的Cr（VI）培养液中，菌株都可以快速生长，基本上没受到抑制，特别是在25 mg/L Cr（VI）浓度下，生长趋势最好。但当Cr（VI）浓度达到400 mg/L 时，菌株的生长达到了延滞期，生长受到了抑制。菌株Y1 对Cr（VI）的还原效率随着初始Cr（VI）浓度的升高而下降，在25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的初始Cr（VI）浓度条件下，菌株的铬还原率分别为88.0%、54.1%、31.2%、24.5%和17.5%。随着初始Cr（VI）浓度升高，菌体Y1 的耐受性和生长受到抑制，铬对菌体的致毒性加强，阻抑了菌株铬还原酶的能力，使还原效率降低。

图7 不同初始Cr（VI）浓度下菌株Y1 的还原特性

3 结论

（1）从台山广海湾惰性拆建物料处置区沉积物中分离得到一株Cr（VI）抗性菌，通过菌落形态、革兰氏染色和16S rRNA 基因测序分析，鉴定该菌株为芽孢杆菌（Bacillus），编号为Y1。

（2）菌株Y1 在2216 培养基中8 h～22 h 时处于对数生长期，生长速度最快；菌株最适生长pH 为7.5；最适生长温度为35 ℃；能耐受高盐环境。

（3）菌株Y1 对25 mg/L～400 mg/LCr（VI）的还原趋势随着初始Cr（VI）浓度的升高而下降，在25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的初始Cr（VI）浓度条件下，菌株的铬还原率分别为88.0%、54.1%、31.2%、24.5%和17.5%。下一步拟对芽孢杆菌吸附机理进行研究，为后续实验奠定基础；并探讨高浓度Cr（VI）对芽孢杆菌活性以及除铬能力的影响机理。