基于网络药理学的养精种玉汤改善种植窗期子宫内膜容受性机制分析

段培培， 叶振冲， 范 文， 李天强， 于聪聪， 相如兰

(南阳理工学院 河南 南阳 473004)

0 引言

种植窗期，良好的子宫内膜状态是胚胎能否顺利植入母体的关键环节。处于激活状态的囊胚，通过黏附、侵袭、植入子宫蜕膜，开启母胎循环。同时要求母体子宫内膜同步建立良好的接受态，此状态持续1～2天，是胚胎着床和早孕绒毛侵袭母体的黄金时期。当前影响子宫内膜容受状态的因素主要涉及解剖器官异常、排卵障碍型疾病、手术器械所致的内膜损伤、宫腔粘连、宫腔内器质性病变等诸多方面，发病机制多样且复杂，治疗难度大，以手术、药物对症治疗为主，疗效因人而异。因此，明确发病机制且寻求有效的中西医结合方法是治疗本病的关键。中医学安胎由来已久，基于“肾系胎、血载胎”的生殖理论，认为精亏血少是胚胎着床失败的常见病机，当补肾填精、养血载胎。傅氏“调经种子”经世名方养精种玉汤，由熟地黄、白芍、当归、山茱萸组成，特于补血，纯于填精，主治肾亏血虚，久不受孕。但中药复方成分复杂，作用靶点尚未阐明。因此，本研究拟运用网络药理学方法，由药物活性成分、潜在靶点为切入点，探究养精种玉汤改善子宫内膜容受性的多重分子机制。

1 材料与方法

1.1 有效成分及其靶点基因的检索

以 “熟地黄、山茱萸、当归、白芍”为关键词，导入TCMSP数据库，设置OB≥30% ，DL≥0.18，进行养精种玉汤有效活性成分的筛选，并检索出相关靶点；随后将靶点导入Uniport数据库，搜索物种为“Homo sapiens”，进行基因名称校正。

1.2 疾病靶点的筛选

以 “Endometrial receptivity during implantation window”为关键词，导入 Genecards数据库、DRUGBANK数据库，检索相关的靶点基因并保存。

1.3 “养精种玉汤-种植窗期子宫内膜容受性”的蛋白间相互作用可视图的构析

Venny R软件比对分析药物和疾病靶点，绘制韦恩图“药物-疾病”交互靶点。Cytoscape 3.7.2软件构建一体“药物-疾病”蛋白网络互作图，进行可视化分析。

1.4 “化合物-有效成分-作用靶点-疾病靶点”的可视化分析

将以上的“有效成分及其靶点基因、疾病靶点基因、药物-疾病的交集蛋白靶点” 导入Cytoscape，进行可视化网络分析。

1.5 基于David进行GO及KEGG富集分析

将1.3节中交互靶点导入David数据库进行基因本体(GO)富集分析，分别描述靶点的生物学过程(GO-BP)、细胞组分(GO-CC)、分子功能(GO-MF)；同时进行基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，获得相关生物学过程和各条关键的信号通路。

2 结果

2.1 养精种玉汤有效活性成分的筛选

通过 TCMSP 数据库检索出养精种玉汤所含化合物：熟地黄76 种、当归 125 种、山茱萸 226种、白芍85种；在OB≥ 30% 、DL ≥ 0.18 的条件下，获得37种有效化学成分，其中熟地黄 2 种(谷甾醇、豆甾醇)、当归 1种(β-谷甾醇)、山茱萸 20种(山茱萸环烯醚萜及苷、多糖类等)、白芍13种(芍药苷、芍药内酯苷等)，将重复性的药效成分删除不计入，共计31种药效成分被查找到(部分主要成分见表1)。

表1 养精种玉汤的31种有效活性成分

2.2 疾病靶点的筛选

设置关键词为“Endometrial receptivity during implantation window”，检索结果数量分别为378、377。去除搜集到的重复靶点后，导入Uniport 数据库，对靶点基因进行简称化。相关性分数提示靶点与子宫内膜容受性的关联紧密度，二者呈正相关。依据相关性分数排序，排名前10位的靶点信息见表2。

表2 种植窗期子宫内膜容受性的部分靶点及靶点描述

2.3 “药物-疾病”交集作用靶点的预测分析

将2.1节中31种有效成分所对应的114个作用靶点和4209个子基因，与2.2节中的378个疾病靶点，导入Venny R 分析软件，绘制交集靶点韦恩图(见图1)，图中获取249个“药物-疾病”交集靶点基因，其中黏附分子(CD44)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、整合素α5(ITGα5)、氧化氮合酶(NOS2)、间质-上皮细胞转化因子(MET)等参与细胞生长、黏附、侵袭过程。内皮素1(EDN1)、血管内皮生长因子(VEGF)等参与血管平滑肌收缩、血管生成，调控组织血流灌注。CXC族趋化因子受体(CXCR4)、瘦素(LEP)、叉头转录因子(FOXP3)等激活细胞免疫、炎症活动，调节免疫-炎症微环境。分析计算得出靶点基因映射率为5.9%，提示该方对于改善子宫内膜容受状态特异性显著。

图1 养精种玉汤与种植窗期子宫内膜容受性的 249 个交集靶点韦恩图

2.4 养精种玉汤与种植窗期子宫内膜容受性交集靶点的 PPI 网络分析

将2.3节中所获得的249个交集靶点导入String数据库，设置搜索物种为 “人”，medium confidence筛选值设为大于0.900(有统计学意义)，得到“药物成分-疾病关联蛋白”的互作信息图。后将获取的蛋白互作信息以tsv形式导入 Cytoscape软件中分析，筛选度值最大且相同的两个节点—STAT3、APP及其有互作关联的其他靶点。依据度值越大，该基因或通路对疾病的影响越大，筛选出排前30位的节点(见图2)。其中KNG1(激肽原-1)在不同条件下，可激活AKT(蛋白激酶)、EGF(表皮生长因子)、EGFR(表皮生长因子受体)、FN1(纤维连接蛋白)、MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)、STAT3(信号转导与转录激活因子3)等信号通路，参与细胞生长、增殖、侵袭等生理活动。TNF(肿瘤坏死因子)协同IL6(白介素6)、IL10(白介素10)等激活免疫-炎症反应，调控种植窗期子宫内膜微环境。VEGFA(血管内皮生长因子A)协同STAT3、EGFR等调节血管生成，改善子宫内膜血流灌注。上述靶点可能是通过不同角度改善子宫内膜容受性促进种植窗期胚胎顺利着床的关键靶点。

图2 养精种玉汤改善种植窗期子宫内膜容受性度值排名前30位的较大节点注：横坐标代表靶点的度值；纵坐标为排名先后的各节点

2.5 GO 富集分析

将疾病核心靶点基因导入Enrichr数据库进行GO富集分析，得到具有统计学意义的88条富集结果(P<0.01)，其中排名前20的主要涉及癌症相关通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K-Akt)、缺氧诱导因子(HIF-1)、叉头转录因子(FoxO)、Toll样受体4(TLR4)等信号通路。David 6.8 数据库对交集靶点进行功能注释分析，结果显示BP、CC、MF数量，分别为644、55、88(P<0.01)。其中BP主要包括白介素的正向调节、各类蛋白激酶活性激活，树突细胞-细胞因子的免疫应答，细胞增殖、凋亡、侵袭的信号转导，性激素水平(雌、孕激素的分泌及代谢过程)等。CC主要集中于细胞免疫突触、内吞囊腔、细胞外囊泡、血液微粒、RNA聚合酶Ⅱ转录因子、Wnt 信号复合体等，MF主要体现在蛋白质粒子结合、HMG结构域结合、参与Wnt 信号通路的受体激活、支架蛋白结合、细胞间钙黏蛋白结合、细胞基质胶原区域结合等方面。

2.6 KEGG 信号通路富集分析

将2.3节中所获得的249个“药物-疾病”交集靶点基因导入David 6.8数据库，方法同1.5节进行KEGG富集分析，得到具有统计学意义的101条信号通路(P<0.01)。选择排名前20的信号通路进行可视化分析(见图3)。图中气泡的直径与该富集通路中蕴含的基因个数呈正相关；气泡灰度表示伪发现率，其深浅与该富集通路的伪发现率呈负相关。

图3 养精种玉汤改善种植窗期子宫内膜容受性的KEGG信号通路气泡图注：气泡的直径大小表示通路中的靶点基因数量；颜色深浅代表伪发现率(FDR值)

3 讨论

妊娠早期，胚胎能否顺利植入母体子宫历经着一系列有序且复杂的生理学过程，其要求激活状态的胚胎与母体内膜的容受状态保持同步。因此，种植窗期子宫内膜接受态的建立和良好母胎界面微环境的形成是其关键环节，亦是胎儿得以生长、发育的组织学基础。当前临床医学诊疗子宫内膜源性疾病的方法以彩超、宫腔镜等检测其形态学变化、血流灌注等，蛋白组学、代谢组学和单细胞测序分析其分子机制靶点[1-3]，但其成本昂贵、个体差异显著，治疗仍以手术、药物对症治疗为主。而中医安胎历经千年，流传至今，有着自身独特优势和治疗理念。傅山(清)[4]提出：“精满则子宫易于摄精，血足则子宫易于容物，皆有子之道也”，认为胎元初结于母体胞宫，需精满气盛，血脉畅达，此得以载胎至足月。本方由补血调经第一名方——四物汤加减化裁而成，方中去川芎而特加山萸肉以滋补肝肾，补益精血，使养精种玉汤全方药物配合不特于补血，而纯于填精。方中重用填精之要药九蒸九制熟地黄，配伍蒸熟山茱萸，其妙在于补中带收，正应“肾主封藏”之象；当归补益精血，补而不腻；白芍养血柔肝，养中有行，行中有敛。全方配伍严谨，诠释了“精满血足，方可种子”的经典生殖理论。

当前中医药的传承发展以临床积累、师承研究为主，中药复方虽疗效显著，但因其成分复杂、靶点繁多，具体的作用机制尚未明了。而网络药理学作为高效的生物信息学分析方法，为进一步研究中药成分的分子机制提供方向。临床中子宫内膜容受性低下主要涉及子宫因素的内膜过薄、内膜息肉、子宫内膜炎性改变、宫腔粘连和卵巢分泌功能紊乱[5]等方面，发病机制与卵巢性激素分泌、种植窗期母胎界面母体子宫内膜局部分子[6]及胎源性分泌的因子异常有关。研究结果显示，养精种玉汤所含口服利用率较高的β-谷甾醇、豆甾醇、芍药苷、山茱萸多糖、山茱萸环烯醚萜及苷、芍药内酯苷等可能是改善种植窗期子宫内膜容受性的主要生物活性成分。后通过成分-疾病靶点网络分析可知，STAT3、APP、IL6、KNG1、MAPK3、MAPK1、VEGFA、FN1、AKT1、EGF等核心靶点在改善种植窗期子宫内膜容受性时发挥主要作用，主要体现在调控子宫内膜适度增殖、凋亡，促进内膜生长、血管生成及改善母胎界面免疫-炎症微环境方面。虽该方治疗妇科领域疾病的机制研究甚少，但已有学者证实方中有效活性成分通过调控上述靶点，广泛应用于其他疾病的临床治疗中。石和元[7]等证实山茱萸多糖可以通过调节IL-2、IL-10的蛋白表达，CD4+、CD8+T细胞水平，平衡Th1/Th2比值，提高小鼠的免疫功能。周强[8]等证实β-谷甾醇可以通过下调TNF-α、FN、Cas-3水平，上调IL-1β、IL-4表达，抑制肺组织凋亡，改善局部免疫-炎症微环境，延缓急性肺损伤所致的纤维化进程。王贞丽[9]等发现芍药苷可通过改善血管内皮舒缩因子、减轻氧化应激损伤，纠正低氧性肺动脉高压的血管重塑。徐大伟[10]等在体外细胞实验中证实芍药苷可通过负反馈STAT3信号通路，激活垂体瘤细胞凋亡因子，抑制其生长。

本研究中GO及KEGG富集分析提示：该方主要通过调控种植窗期母胎界面细胞增殖和炎症、免疫反应等生物学过程，并在以细胞免疫突触、内吞囊腔、细胞外囊泡及细胞表面为主的细胞组分处发挥良性作用；影响蛋白质粒子结合、性激素水平、支架蛋白结合域、细胞间钙黏蛋白结合、细胞基质胶原结合域及生长因子活性等分子功能；同时以癌症、PI3K-AKT、FoxO、VEGF等信号通路为主参与改善种植窗期子宫内膜容受性以促进胚胎着床的过程，且不同信号通路间存在交叉激活。其中FoxO家族中FOXA2是影响内膜容受性的启动因子，受雌激素的负反馈调控，同时可被Wnt通路、黄体酮激活。活化的FOXA2可通过激活细胞间钙黏蛋白(E-CDH1)，上调白血病抑制因子(LIF)，最终激活JAK/STAT3信号通路[11]，促进种植窗期子宫内膜蜕膜化，调节免疫-炎症应答，促进胚胎顺利着床。此外，当下因手术器械所致的子宫内膜损伤是影响其容受性的常见因素，薄型子宫内膜、血供不足是其主要表现。李新安[12]等发现在子宫内膜胶原结合域(CBD)，CBD-VEGF可特异性与胶原结合，促进内膜螺旋小动脉的生成，改善局部血流灌注，修复受损的子宫内膜及平滑肌。张良[13]等证实养精种玉汤可通过上调反复试管着床失败患者子宫内膜分泌物中VEGF、IL-1β的表达，下调单核细胞趋化蛋白-1的表达，改善种植窗期子宫内膜形态和血流灌注，优化子宫内膜容受状态，提高妊娠率。

综上，养精种玉汤可能通过改善内膜生长、分泌状态和局部血流灌注、平衡母胎界面免疫-炎症微环境，修复内膜损伤等多途径促进胚胎着床。其多成分、多靶点、多通路的作用特点，为深入研究其助孕机制提供方向，为妇科其他炎性疾病、肿瘤疾病的治疗提供诊疗思路和潜在空间。但由于中药复方成分、靶点复杂，后期仍需要大量的动物实验及临床研究的证实。