改良QuEChERS技术快速筛查降尿酸类药食同源食品中的57种非法添加药物

綦 艳 许庆鹏 李 聪 邓幸飞 李锦清

(广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300)

高尿酸血症及痛风是人体内嘌呤代谢紊乱引起的代谢异常综合征[1-2]。中国高尿酸血症及痛风总体患病率达13.3%，且愈来愈趋向年轻化[3]。鉴于养生疾病具有中医治疗的显著特点[4]，各种宣称降尿酸、缓解痛风类药食同源产品应运而生。宣称具有降尿酸、缓解痛风类药食同源食品，主要由桑叶、银杏叶、紫苏叶、菊苣、绞股蓝等制成的茶类或者经粉碎提炼制成的胶囊为主[5]，此类药食同源食品虽然在一定程度上可缓解或减轻患者症状，但是功效性体感不强。降尿酸、缓解痛风类的药物主要有别嘌醇和非布司他等抑制尿酸生成药物，苯溴马隆等促进尿酸排泄药物，糖皮质激素、非甾体抗炎等抗痛消炎药物，如双氯芬酸钠、保泰松片、强的松、萘普生、地塞米松、秋水仙碱等[6-8]。不法商家为提高功效，将上述药物非法添加于药食同源食品中从而达到见效快、疗效好的目的，欺骗消费者，使消费者在不知情的情况下，持续服用含有未知浓度非法添加药物的药食同源食品，虽能短时间内缓解高尿酸血症及痛风症状，但服药量未知，如果长期服用，可能产生不可预知的不良反应[9]。

目前，药食同源食品的研究主要集中于药食同源食品中有效成分[10-11]、重金属及有害元素[12-13]、双酚类化合物[14]、真菌毒素[15-16]、农药残留[17]等的分析检测，但针对药食同源食品中的非法添加问题研究较少。QuEChERS技术是近年来发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，具有灵敏度高、分析范围广、溶剂使用量少、分析速度快、操作简单等优点[18]。研究采用改良的QuEChERS前处理技术对样品进行净化，运用超高效液相色谱—串联三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS)对市场上宣称降尿酸或痛风类的药食同源食品中非法添加的57种药物的含量进行测定，以期为药食同源食品这一中国特色食品的监管提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)：粒径40～60 μm，美国安捷伦公司；

石墨化炭黑(GCB)：粒径100～200 μm，美国安捷伦公司；

十八烷基键合硅胶(C18)吸附剂：粒径40～60 μm，美国安捷伦公司；

美洛昔康、非布司他、丙磺舒等57种标准品：纯度≥98%，德国Ehrenstorfer公司。

1.1.2 主要仪器设备

超高效液相色谱—串联质谱仪：AB Triple Quad 4500型，美国SCIEX公司；

漩涡混合器：IKA MS3型，德国IKA公司；

高速冷冻离心机：3-3KS型，美国SCIEX公司；

去离子水发生器：Milli-Q型，美国Millipore公司；

高速粉碎机：A11型，德国IKA公司。

1.2 样品前处理

茶类制品使用高速粉碎机破碎后使用，胶囊样品取出内容物进行使用。

准确称取1 g试样(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，准确加入甲醇10.0 mL，盖上盖子，涡旋1 min后超声提取30 min，离心5 min，移取上清液加入2 mL QuEChERS净化管中，涡旋提取2 min，离心5 min，过0.22 μm有机相滤膜，待测。

1.3 仪器条件

1.3.1 LC-MS/MS液相条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相与梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相与梯度洗脱条件

1.3.2 LC-MS/MS质谱条件 采用正负离子同时检测模式，毛细管电压：5.5 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；多反应监测模式(MRM)模式；碰撞气体：氦气。质谱参考条件见表2。

1.4 数据处理

通过AB Triple Quad 4500仪器配置工作站SCIEX OS-MQ Software系统进行数据采集分析，利用Microsoft Excel 2010软件、Origin 2018进行数据分析及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

57种非法添加药物种类多，结构复杂，据文献[18]报道丙磺舒和苯溴马隆在负离子模式下响应值高，而别嘌醇在正离子模式下有较好响应，研究对药食同源食品中57种非法添加药物标准溶液进行质谱全扫描，得到57种非法添加药物的一级母离子，通过二级质谱扫描得到信号稳定、信号强度较大的特征碎片离子，选择无干扰、灵敏度高、相对丰度最高的离子作为定量离子，相对较弱的作为定性离子，并优化57种非法添加药物的母离子和子离子所需的最佳去簇电压和碰撞气能量，以MRM模式进行扫描，除苯溴马隆、丙磺舒、吲哚美辛、双氯芬酸钠在负离子模式较正离子模式下响应更好外，其余53种物质均在正离子模式下响应更好(见表2)。

表2 质谱参考条件†

续表2

2.2 色谱条件的选择

为确定最佳分离条件，研究考察了Shim-pack ODS-Ⅱ(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)、Agilent SB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)以及ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)3种型号的色谱柱对57种非法添加药物的分离效果，Agilent SB-C18色谱柱由于具有较大的二异丁基侧链基团，使增加空间位阻的关键基团硅氧烷键合到了硅胶表面，从而此柱在低pH条件下的峰形更为出色。在电喷雾正离子、负离子同时扫描模式下，Agilent SB-C18色谱柱存在峰形较差，负离子响应度不好的情况。Shim-pack ODS-Ⅱ能够耐受更高的压力，色谱柱长度越长分离度越好，使用Shim-pack ODS-Ⅱ色谱柱地塞米松与倍他米松不能实现完全分离，改变流动相及流动相比例均未实现分离，可能由于此柱较短，物质的保留时间短，较难分离母离子相同的物质；ACQUITY UPLC BEH C18是三键键合式烷基柱，在不同pH的条件下均有稳定的灵敏度和分离度。在相同色谱条件下ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离得到的色谱峰峰型较好，且57种非法添加药物分离度良好，ACQUITY UPLC BEH C18柱与Shim-pack ODS-Ⅱ柱分离地塞米松与倍他米松的效果图见图1(a)和图1(b)。综上所述，选择ACQUITY UPLC BEH C18柱进行进一步试验。

试验考察了甲醇和乙腈作为流动相的差异，发现糖皮质激素在色谱柱上的保留较强，乙腈洗脱能力较甲醇强，能将57种非法添加药物较快速洗脱，且分离效果较好，为了得到更好的分离效果以及更好的峰形，试验考察了乙腈—0.1%甲酸溶液、乙腈—10 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈—水3种流动相体系。在乙腈—0.1%甲酸溶液流动相体系中，57种非法添加药物中地塞米松醋酸酯和倍他米松双丙酸酯两种标准物质不能实现分离且丙磺舒、苯溴马隆响应度不高，可能由于0.1%甲酸溶液流动相适用于正离子模式下物质的分离。而在乙腈—10 mmol/L乙酸铵溶液流动相体系中57种物质均响应度不高，在乙腈—水流动相体系中57种非法添加药物分离度较好且各物质响应度较高，经过优化确定该试验的最佳梯度洗脱条件见表1。

2.3 样品前处理条件的确定

宣称降尿酸、缓解痛风类药食同源食品成分多样、基体复杂、干扰严重且含有大量植物色素，固相萃取技术能有效去除基质干扰提高富集倍数，但是研究在净化阶段遇到多次堵塞固相萃取柱现象，使试验难以进行。QuEChERS前处理技术能解决传统固相萃取柱的净化过程慢且堵塞固相萃取柱的缺陷。QuEChERS提取技术常规处理过程第一步为萃取，通常以乙腈为提取试剂，提取后加入无水MgSO4和NaCl，离心分层，但试验过程发现乙腈作为提取试剂时，糖皮质激素及部分非甾体抗炎回收率可以达到GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，但酮咯酸、美洛昔康、秋水仙碱、非布司他、别嘌醇、苯溴马隆、丙磺舒、吲哚美辛8种物质回收率却未达到标准要求，选择极性更大的甲醇作为提取试剂，提取后加入无水MgSO4和NaCl，无明显分层且导致部分提取溶剂有损失。由于研究样品为茶叶干制品或者胶囊制品，含水量较小，无需盐析分层，故试验选择甲醇作为提取溶剂并取消加入无水MgSO4和NaCl的盐析分层过程。QuEChERS前处理技术常用的吸附剂有C18、GCB和PSA等，吸附剂种类及含量影响QuEChERS净化效率及回收率。试验发现PSA、GCB对于去除植物样品的色素具有较好的效果，经过两种吸附剂剂量优化选择含150 mg PSA、50 mg GCB的2 mL QuEChERS净化管对样品进行净化。

图1 ACQUITY UPLC BEH C18柱和Shim-pack ODS-Ⅱ柱分离地塞米松与倍他米松的效果图

称取1 g粉碎试样于50 mL塑料离心管中，准确加入甲醇10 mL进行提取，提取后离心直接移取上清液加入2 mL QuEChERS净化管(含150 mg PSA、50 mg GCB)中进行净化，提高了57种非法添加物质回收率的同时降低了基质干扰(图2)。综上所述，研究选择改良的QuEChERS提取技术对宣称降尿酸、缓解痛风类药食同源食品进行目标物质提取，提高目标物质的回收率，解决了传统固相萃取法溶剂消耗量大且针对此类药食同源食品易堵塞的问题。

图2 提取溶剂对加标食药同源食品中8种非法添加物质提取效率的影响

2.4 检出限、定量限、标准曲线、线性范围

以57种非法添加药物峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，绘制线性回归方程，得到57种化合物的线性回归方程。57种非法添加药物在5～200 μg/L的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(R2)均在0.99以上。在空白样品中添加57种非法添加药物的标准物质溶液，以3倍信噪比、10倍信噪比分别计算该方法的检出限、定量限以及相对标准偏差(relative standard deviations，RSDs)，结果见表3。57种非法添加药物的检出限为0.03～0.10 μg/kg，平均回收率为79.4%～92.6%，RSDs为0.86%～5.61%。在最优条件下57种非法添加药物的色谱峰形和响应强度最好，保留时间稳定(见图3)。

2.5 加标回收率及精密度

在空白样品中分别添加57种非法添加药物混合标准溶液制成0.10，0.20，1.00 μg/kg三水平加标样品，称取加标样品1 g于50 mL塑料离心管中，准确加入甲醇10 mL进行提取，提取后离心直接移取上清液加入2 mLQuEChERS净化管(含150 mg PSA、50 mg GCB)中进行净化，提取2 min，离心5 min，每个水平做6组平行，计算平均回收率，其平均回收率为79.4%～92.6%，相对标准偏差均小于10.0%，表明该方法测定准确，回收率好。具体结果见表3。

表3 57种非法添加药物的线性范围、回归方程、工作曲线、方法检出限及相对标准偏差

续表3

2.6 实际样品的检测结果

在网络及实体店采购药食同源食品50批次，采用研究所建方法对50批次样品进行处理，检测57种非法添加药物，2批次网络采购样品检出别嘌醇，含量分别为36，11 μg/kg，检出率为4.0%，说明药食同源食品添加降尿酸或痛风类药物的风险依然存在，具有此类宣称的药食同源食品监管仍需继续加强。

自下往上各峰依次对应酮咯酸、丙磺舒、对乙酰氨基酚、双氯芬酸钠、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氢化可的松醋酸酯、泼尼松醋酸酯、布地奈德、氟米龙醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯替泼诺、环索奈德、甲基泼尼松龙醋酸酯、曲安西龙双醋酸酯、美洛昔康、非布司他、曲安西龙、泼尼松、可的松、倍他米松、地塞米松、氟尼缩松、氟米龙、地夫可特、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、氢化可的松戊酸酯、泼尼卡酯、安西奈德、氟替卡松丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、双氟可龙戊酸酯、苯溴马隆、别嘌醇、秋水仙碱、泼尼松龙、氟米松、地索奈德、泼尼松龙醋酸酯、可的松醋酸酯、氢化可的松丁酸酯、氟轻松醋酸酯、哈西奈德、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯、氢化可的松、异氟泼尼松龙、氟氢可的松醋酸酯、曲安奈德、氟氢缩松、卤美他松、氟轻松、曲安奈德醋酸酯、卤倍他索丙酸酯、吲哚美辛、二氟拉松双醋酸酯

3 结论

研究改进QuEChERS净化方法，建立了超高效液相色谱—串联三重四极杆质谱方法对药食同源食品中57种非法添加药物的检测。57种非法添加药物检出限为0.03～0.10 μg/kg，平均回收率为79.4%～92.6%，RSDs为0.86%～5.61%。该方法前处理相对简单方便、回收率较常规固相萃取高，且易于操作、灵敏度高、检出限低，能够满足对药食同源食品中57种非法添加药物的快速检测和确证的要求。