磺酰脲类除草剂分子印迹聚合物制备及其应用

冯格格，王猛强，李 壮，佘永新，王 淼，曹 振，王珊珊，郑鹭飞，金茂俊，王 静，邵 华，金 芬

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

磺酰脲类农药作为一种常用的田间除草剂可以有效防除顽固杂草，该类除草剂分子结构由芳香基、磺酰脲桥和杂环3 部分组成，通过利用不同植物代谢能力、代谢途径和降解水平的差异实现对杂草的选择，其被植物的根、叶吸收后，在植物的韧皮部和木质部传导，通过抑制乙酰乳酸合成酶的生成抑制植物细胞的分裂增长，从而达到除草的目的[1]。因其用量小、活性高、对哺乳动物毒性较低的特点，磺酰脲类除草剂已被广泛应用于水稻、小麦、大麦、大豆、油菜等农作物的田间除草[2]，但由于磺酰脲类除草剂大多属于长残效除草剂，其残留极易对敏感作物造成毒害，甚至影响下茬作物的生长[3]。此外，因磺酰脲类除草剂作用位点单一，在特定地块的连续施用会使杂草产生抗药性，由此引发药物滥用的恶性循环将会对生态环境带来重大的安全风险。人们食用了超出残留限量的植物源性食品后，对健康产生风险，甚至引起急性中毒。

目前针对磺酰脲类除草剂的残留检测日益成为食品安全领域的研究重点。各国家先后制定了多种磺酰脲类除草剂的最高残留限量。美国规定苯磺隆和噻吩磺隆在玉米和高粱的草料、谷粒、秸秆及豆科作物种子中的最高残留限量为0.05 mg/kg。GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》中规定噻吩磺隆、单嘧磺隆、环丙嘧磺隆、甲磺隆、氯磺隆等在部分农产品中的最大残留限量[4]。农业部第2032号公告还对氯磺隆等7种农药采取限用管理措施，逐步限售、禁用部分危害性较高的磺酰脲类除草剂，并先后制定了多种磺酰脲类农药的残留检测方法。目前的分析方法主要包括：高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术[5]、高效液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）联用技术[6]、气相色谱-质谱联用技术[7]、毛细血管电泳色谱法[8]、生物测定法[9-10]、酶联免疫分析技术[11-12]等。由于检测设备在灵敏度上存在局限性，加之复杂基质对残留检测结果极易受到干扰、弱化，现有的检测方法很难对种类较多的磺酰脲类除草剂进行准确、快速的痕量分析[13-14]，其中样品前处理技术是解决当前检测技术精准度不高的主要途径。

分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一种具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料，分子印迹技术基本原理如下[15]：模板分子与功能单体依靠相互作用力（如氢键、共价键、离子键、范德华力、疏水相互作用以及空间位阻效应等），在合适的分散介质中形成可逆结合的复合物，当交联剂存在时，经光、热、电场及引发剂引发，形成具有一定刚性和柔性的具有立体孔穴的高分子聚合物。之后除去模板分子，得到在空间和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物，即MIPs。MIPs不仅专一性高、制备简单，而且与天然的分子识别体系（如抗原和抗体、酶和底物）相比，具有高度稳定性和更长的使用寿命[16-19]。以其作为固相萃取柱填料制备的分子印迹固相萃取（molecularly imprinted solid-phase extraction，MI-SPE）柱，与传统的固相萃取柱相比，它克服了样品基质复杂、富集效果差以及无再生性等不利因素，有效提高了分析准确性和灵敏度，更适用于痕量分析[20-21]。

课题组以甲磺隆为模板分子，利用沉淀聚合法合成磺酰脲类MIPs，并将其与制备的金属有机框架（metal organic frameworks，MOFs）材料掺杂混合作为复合填料制成MI-SPE柱，结合HPLC-MS，发展了大米样品10种磺酰脲快速检测方法[22]；Bastide等[23]制备了对甲磺隆等6种磺酰脲类除草剂都具有较好结合能力的MIPs；Liu Xiangjun等[24]合成了具有规则外形的甲磺隆MIPs球，可从甲磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆和噻吩磺隆中较好地识别甲磺隆并可以应用于实际水样的液相色谱检测；Peng Yan等[25]首先通过硅烷化作用将双键嫁接在二氧化硅纳米颗粒的表面，合成了甲磺隆MIPs涂层的二氧化硅纳米颗粒，可应用于土壤、大米、大豆和谷物样品中甲磺隆、氯磺隆、苯磺隆和噻吩磺隆的检测；王宁[26]和Dong Xiaochao[27]等采用紫外光引发溶液聚合法合成了单嘧磺隆MIPs，并被成功地用作固相提取剂对土壤样品中的单嘧磺隆进行有效富集与净化；郑亚丽等[28]制备了氯磺隆MIPs微球，可作为固相萃取填料用于检测烟叶中6种磺酰脲类除草剂；李蓉等[29]建立了复合分子印迹固相萃取-高效液相色谱-三重四极杆串联质谱同时检测多种植物源性食品中3种磺酰脲类除草剂残留的分析方法。然而这些方法只能对特定几种磺酰脲类农药进行检测，适用范围窄，目前各种农产品中使用磺酰脲除草剂的种类高达30多种，现有的方法都无法满足快速检测29种，因此开发高通量高效样品前处理技术的一步式检测29种磺酰脲类具有很好的研究价值。

因此，本研究利用双模板分子，采用沉淀聚合法制备了磺酰脲类MIPs，研究聚合物的吸附性能，并将其作为填料制备MI-SPE柱，建立农产品中29种磺酰脲类除草剂残留量测定的MI-SPE/HPLC-MS/MS。与已有文献相比[22-29]， 本实验建立的MI-SPE/HPLC-MS/MS方法具有前处理简单、选择性好、回收率高、检测限低、灵敏度高、一次处理样品可检测29种磺酰脲类农药残留的特点。该方法可用于农产品中29种磺酰脲类除草剂的残留检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷物、蔬菜、水果、食用油等农产品为北京市购；4-乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-VP）、二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB） 上海Aladdin公司；偶氮二异丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN） 北京百灵威 公司；甲醇、乙腈、正己烷（均为色谱纯），甲酸、冰乙酸、磷酸（均为分析纯） 美国Thermo Fisher Scientific公司；氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾三水合物（均为分析纯） 北京化学试剂公司；超纯水由法国 MilliQ纯水机制备；29种磺酰脲类农药标准品：苄嘧磺隆、苯磺隆、烟嘧磺隆、氯磺隆、噻吩磺隆、单嘧磺隆、胺苯磺隆、氯吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、甲基碘磺隆钠盐、醚苯磺隆、乙氧嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、氟唑磺隆、嘧苯胺磺隆、酰嘧磺隆、甲磺隆、噻苯隆、氟吡磺隆、环丙嘧磺隆、醚磺隆、砜嘧磺隆、氟磺隆、氟胺磺隆、甲嘧磺隆、氟嘧磺隆、磺酰磺隆、甲酰胺磺隆（纯度均大于98%） 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与设备

1200液相色谱仪、API5000串联四极杆质谱仪 美国Agilent公司；MS200型多管涡旋混匀仪 杭州瑞诚仪器有限公司；AL104型电子天平 瑞士梅特勒-托利多 公司；Biofuge Stratos型台式高速冷冻离心机 美国 Thermo公司；ZK-82A型真空干燥箱 上海路达公司；KQ2200DB3L型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司； D10-12型干热式氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磺酰脲类MIPs的合成

将甲磺隆和氯磺隆（物质的量比为1∶1）置于150 mL的圆底烧瓶中，加入一定量的乙腈溶解，待模板分子完全溶解后加入4-VP（与模板分子物质的量比为4∶1），置于摇床上预聚合60 min。加入DVB（与模板分子的物质的量比10∶1）和一定量的引发剂AIBN，超声10 min，充氮气除氧10 min，密封后放入60 ℃水浴锅振荡 （140 r/min）反应24 h。反应结束后，过滤得到沉淀，用甲醇冲洗2～3 次，55 ℃真空干燥。之后在索氏提取器上用乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液洗脱模板，直至紫外分光光度计检测不到模板分子。非分子印迹聚合物（non molecularly imprinted polymers，NIPs）的制备除不加模板外，其余步骤与MIPs）相同。

1.3.2 聚合物的吸附性能表征

选取6种主要的磺酰脲类农药对其进行吸附性能研究。分别称取MIPs和NIPs 40 mg置于2 mL离心管中，加入1 mL不同质量浓度的磺酰脲类溶液，恒温振荡9 h，离心取上清液，HPLC测定其质量浓度，根据式（1）计算MIPs和NIPs对不同质量浓度磺酰脲类农药的吸附量Q，并绘制等温吸附曲线。根据式（2）Scatchard方程计算印迹聚合物的结合常数及最大表观吸附量：

式中：Q为平衡时聚合物对分析物的吸附量/（μg/g）；Qmax为最大表观吸附量/（mg/g）；C0为磺酰脲类农药初始质量浓度/（mg/L）；Ce为平衡时上清液中磺酰脲类农药质量浓度/（mg/L）；V为加入磺酰脲类溶液的体 积/mL；m为加入聚合物的质量/mg；Kd为平衡离解常数。

1.3.3 分子印迹固相萃取方法的建立

采用湿法装柱的方式，在保证吸附效率的同时考虑经济效益，故选择填柱量为40 mg；由于MIPs在水中的分散性不佳，选择2 mL乙醇为溶剂（柱上下两端的筛板压的力度要适中，太实会导致阻力大，溶液不能自然滴落；太松会导致目标物不能与聚合物充分接触，从而使吸附量降低），制备磺酰脲类MI-SPE柱。活化：3 mL甲醇-3 mL水，并确保水在柱中未完全流干；上样：准确吸取1 mL pH 8.0的PBS样品溶液作为上样液，流速为 1 mL/min；淋洗：1 mL水淋洗，流干；洗脱：3 mL 乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液为洗脱液洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，氮气吹干，1 mL乙腈再次复溶后，经0.22 μm微膜过滤，待测。

1.3.4 实际样品检测

1.3.4.1 提取

玉米、大豆油：准确称取均质后的样品2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL超纯水、10 mL乙腈溶液、4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠；高速匀浆5 min，静置30 min，4 000 r/min离心5 min；10 mL乙腈溶液提取步骤重复3 次，合并上清液；完全转移上清液于圆底烧瓶中，加入15 mL乙腈饱和的正己烷溶液，涡旋5 min，静置10 min，分层；弃去上层正己烷层，将下层乙腈层旋转蒸发浓缩至近干；加入2 mL磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）复溶，待净化。

黄瓜、梨：准确称取均质后的样品2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈溶剂、4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠；高速匀浆5 min，静置30 min，4 000 r/min离心5 min；乙腈溶剂提取步骤重复3 次，合并上清液，完全转移上清液于圆底烧瓶中，旋转蒸发浓缩至近干；加入2 mL PBS复溶，过0.22 μm有机滤膜，待净化。

1.3.4.2 净化

按照优化好的步骤进行活化、1 mL上样液上样、淋洗、洗脱程序。洗脱液氮吹后用1 mL乙腈进行复溶，过0.22 μm有机滤膜，通过HPLC-MS/MS检测回收率。

1.3.5 色谱条件

Shim-pack GIST C18色谱柱（75 mm×2.1 mm，2 μm），柱温35 ℃，流速0.4 mL/min，进样体积1 μL，流动相组成及梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相组成及梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase composition and gradient elution conditions

1.3.6 质谱条件

电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）源，毛细管电压为4 000 V，毛细管温度为300 ℃，雾化气流量为3.0 L/min，碰撞气类型为氩气，检测方式：多反应监测，质谱参数条件见表2。

表2 质谱参数Table 2 MS parameters

2 结果与分析

2.1 磺酰脲类MIPs制备条件的优化

首先对模板分子进行选择。由于有30余种商用的磺酰脲类除草剂，因此开发一种具有良好净化效果的类特异性分子印迹-固相萃取方法，用于同时测定复杂基质中的多种磺酰脲类除草剂，作为理想和实用的常规监测。双模板分子印迹策略最近被证明是一种有效的方法，因为采用双模板分子可以在一种MIPs中产生多重识别位点，同时提供更大的吸附容量。模板分子是MIPs中最重要的部分，它的结构直接影响所得聚合物的性质[30-33]。甲磺隆和氯磺隆是最开始被开发使用的磺酰脲类除草剂，其他种类的磺酰脲类除草剂都是在其结构基础上进行取代基的改变而合成的。基于甲磺隆和氯磺隆的结构特性以及良好的热稳定性，故选择二者作为双模板分子，使其与功能单体通过共价或非共价键的相互作用形成稳定的复合物。从图1可看出，采用双模板 （甲磺隆∶氯磺隆=1∶1，n/n）作为模板分子制备的聚合物对目标物的吸附量远大于单模板，证明了采用双模板分子可以在一种MIPs中产生多重识别位点，同时提供更大的吸附容量。根据模板分子和功能单体的分子结构，推测其原理可能是由于功能单体的吡啶基团和模板分子磺酰脲桥上的质子之间形成了氢键，也可能是功能单体的芳香族基团和模板分子之间的π-π相互作用导致。

图1 不同模板分子的比较Fig. 1 Effect of different template molecules on adsorption capacity of MIPs for sulfonylurea pesticides

采用沉淀聚合法，按照表3聚合体系进行筛选和优化，确定了聚合物的制备体系。结果表明：以甲磺隆和氯磺隆1∶1混合为模板分子，4-VP为功能单体，DVB为交联剂（三者物质的量比为1∶4∶10），乙腈为致孔剂时，制备的聚合物吸附量最高，此时可获得对磺酰脲类农药具有较好的特异性识别性能和吸附容量的MIPs，故选择此体系为聚合物的最终制备体系。其原理可能是由于功能单体的吡啶基团和模板分子磺酰脲桥上的质子之间形成了氢键，也可能是功能单体的芳香族基团和模板分子之间的π-π相互作用导致。

表3 聚合物制备体系的优化Table 3 Optimization of polymerization system

2.2 磺酰脲类MIPs的表征

采用扫描电镜对聚合物的表面形貌和结构进行表征。以甲磺隆和氯磺隆为双模板分子，4-VP为功能单体，DVB为交联剂（三者物质的量比例为1∶4∶10），30 mL乙腈作为致孔剂，采用沉淀聚合法制备的MIPs和NIPs。从图2可以看出，MIPs粒径均匀，大约在0.1 μm，而NIPs颗粒不规则，且表面光滑。而MIPs与NIPs团聚体中颗粒的平均尺寸不同，可以表明模板分子在沉淀聚合的成核阶段有影响，在印迹过程中印迹位点的形成起到重要作用。

图2 MIPs（a）和NIPs（b）的扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron micrographs of MIPs (a) and NIPs (b)

2.3 磺酰脲类MIPs的吸附性能

根据不同磺酰脲类除草剂的分子结构特征，选择6种典型的磺酰脲类农药进行静态及动态吸附，获得了在2.1节确定的最优聚合体系下制备聚合物的最大表观吸附量及结合常数，根据聚合物的静态吸附曲线和动态吸附曲线对聚合物的特异性进行评价。由图3可知，不同的磺酰脲类农药动态吸附曲线趋势相同，该6种目标物在9 h之前动态曲线随着时间的延长呈上升趋势，而9 h之后曲线均可达到平衡，故选择9 h作为饱和吸附时间。由图4可知，聚合物在PBS（pH 8.0）中对目标物具有很好的吸附性能，而且随着磺酰脲类目标物初始质量浓度的逐渐增大，聚合物的吸附容量逐渐增大。

图4 MIPs的静态吸附曲线 Fig. 4 Adsorption isotherms of MIPs for sulfonylurea pesticides

由Scatchard方程（图5）可知，Q/Ce与Q整体呈线性关系，Scatchard图是由两部分组成，分别为两条斜率不同的线性直线。这表明MIPs中的结合位点在亲和力方面是异质的（特异性和非特异性结合位点）。根据拟合的线性方程可以计算得出MIPs中结合位点的结合常数Kd以及对应的最大表观吸附量Qmax，计算结果如表4所示，从结果可以看出MIPs对磺酰脲类农药具有良好的吸附性能，其最大表观结合量为13.21 mg/g。

表4 聚合物结合位点的结合常数Kd以及对应的最大表观吸附量QmaxTable 4 Kd and Qmax for binding of sulfonylurea pesticides to MIPs

图5 MIPs的Scatchard方程Fig. 5 Scatchard equations for adsorption of sulfonylurea pesticides by MIPs

2.4 印迹聚合物类特异吸附性

为考察磺酰脲类MIPs的类特异吸附性能，选择三嗪类（莠去津）、三唑类（灭菌唑）和有机磷类（草甘膦）农药作为竞争底物，采用平衡静态吸附实验，通过HPLC法测定聚合物对包括磺酰脲类在内的四大类典型农药的吸附量。MIPs和NIPs的类特异性吸附结果如图6所示。其中MIPs对磺酰脲类、三嗪类、三唑类和有机磷类农药的吸附量分别为2.2、0.8、0.4 mg/g和0.59 mg/g，NIPs分别为1.4、0.3、0.18 mg/g和0.23 mg/g。MIPs对磺酰脲类农药的吸附量明显高于其他3 类农药，表明制备的印迹聚合物对目标分子（磺酰脲类除草剂）具有类特异性吸附的能力。

图6 MIPs类特异性吸附结果Fig. 6 Specific adsorption of sulfonylurea pesticides on MIPs

2.5 磺酰脲类分子印迹固相萃取条件的优化

为得到具有较好特异性吸附和富集效果的MI-SPE方法，对MI-SPE方法的参数进行优化。

首先，选择不同的上样液（乙腈、甲醇、PBS（pH 8.0）、乙腈-PBS（1∶9，V/V，pH 8.0）、乙腈-PBS（1∶1，V/V，pH 8.0）、乙腈-PBS（9∶1，V/V，pH 8.0））以研究目标分析物在MI-SPE柱中的保留效果（图7）。结果表明，当选择PBS（pH 8.0）为上样液时，目标分析物在MI-SPE柱上的保留效果最好。尽管乙腈是聚合过程中的致孔剂，但当上样液中含有乙腈和甲醇时，目标分析物在柱中的保留效果降低。

图7 不同上样液间的比较Fig. 7 Effect of different loading solutions on recoveries of sulfonylurea pesticides

为减少样品基质中杂质的干扰，选择超纯水、乙腈和甲醇作为淋洗液，以进一步优化淋洗液。如图8a所示，当使用乙腈和甲醇作为淋洗液时，目标分析物会不同程度地被洗掉，导致回收率降低，而当选择超纯水作为淋洗液时，可以最大程度地提高目标分析物与结合位点之间的特异性相互作用，并减少非特异性相互作用。由于乙腈和甲醇均可以不同程度从固相萃取柱上洗脱目标分析物，因此，在考察洗脱液时，不仅选择酸化的甲醇，而且选择不同体积的乙腈和甲醇作为洗脱液，对回收率进行比较。如图8b所示，使用3 mL乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液作为洗脱液可确保目标分析物高回收率，故选择3 mL乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液作为洗脱液。

图8 不同淋洗液（a）和洗脱液（b）间的比较Fig. 8 Effect of different washing solutions (a) and elution solutions (b) on recoveries of sulfonylurea pesticides

最终确定的磺酰脲类MI-SPE柱萃取方法为称取40 mg聚合物，以该聚合物作为固相萃取填料，湿法填柱制备了MI-SPE柱。控制流速1 mL/min，以3 mL甲醇、3 mL水为活化液，以1 mL的PBS（pH 8.0）样品溶液为上样液，1 mL纯水作为淋洗液，3 mL 10%乙酸-甲醇为洗脱液，此条件下磺酰脲类目标物回收率最高。

2.6 方法学评价

配制6种系列质量浓度的29种磺酰脲类农药混合标准溶液进行HPLC-MS/MS测定（2、5、10、20、50 μg/L 和100 μg/L），以各组分的3 次平均峰面积（Y）对质量浓度（X，μg/mL）绘制标准曲线，HPLC-MS/MS的线性关系和相关系数见表5。结果表明，29种磺酰脲类除草剂在2～100 μg/L范围内线性非常好，相关系数R2＞0.999，由此可见，本实验方法可满足定量分析要求。

表5 29种磺酰脲类除草剂HPLC-MS/MS测定线性关系Table 5 Linear equations for quantitation of 29 sulfonylurea herbicides with HPLC-MS/MS

续表5

向空白农产品基质中添加29种磺酰脲混合标准溶液，添加量为10、20 μg/kg和50 μg/kg，3个平行，按照1.3.4节的方法进行前处理，用HPLC-MS/MS进行检测。由表6可知，29种磺酰脲类农药在4种不同农产品中的平均回收率在74.8%～110.5%之间，相对标准偏差（n=3）在0.4%～5.3%之间。以方法的最低添加量为定量限（limit of quantitation，LOQ），农产品中29种磺酰脲类农药的LOQ为10.0 μg/kg。

表6 不同农产品中29种磺酰脲类农药的回收率、相对标准偏差和LOQ（n= 3）Table 6 Recoveries, RSDs and LOQs of 29 sulfonylurea herbicides in different agricultural products (n = 3)

2.7 不同检测方法的比较

从样品制备、分离检测技术、分析物个数、基质、线性范围、回收率等方面与其他检测磺酰脲类药物的方法进行比较。如表7所示，开发的MIP-SPEHPLC-MS/MS方法具有灵敏度高、精密度好、检出限低的优点。可用于复杂农产品中29种磺酰脲类药物的特异性检测。

表7 本研究与其他方法测定磺酰脲类除草剂的比较Table 7 Comparison of HPLC-MS/MS with other methods for the determination of sulfonylurea herbicides

3 结 论

利用甲磺隆和氯磺隆为双模版分子，以4-VP为功能单体，DVB为交联剂，乙腈为致孔剂，采用沉淀聚合法制备了磺酰脲类MIPs。实验对聚合物选择性吸附效果进行评价，表明聚合物对磺酰脲类农药具有良好的选择性和吸附性。以此聚合物为填料制备的MI-SPE柱对不同农产品样品中29种磺酰脲类农药进行分离富集，大大降低了HPLC-MS/MS检测中的基质干扰。本实验建立的29种磺酰脲类农药的分析方法将样品的提取、净化和富集一步进行，节约了样品前处理时间，减少了有机试剂的应用，且方法的准确度、精密度及灵敏度均满足残留检测要求，可用于实际样品的检测。