固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中那西肽残留

肖陈贵，沈金灿，朱萍萍，赵凤娟，郭伟杰，康海宁，岳振峰

（深圳海关食品检验检疫技术中心，深圳市食品安全检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518045）

那西肽是一种带5个噻唑环的含硫多肽类抗生素，分子式为C51H43N13O12S6，由12个氨基酸及其衍生物组成，于1961年由法国科学家在链霉素的发酵液中发现[1-3]。 那西肽具有抗病毒、抗菌的作用，对动物有明显的促生长作用，已被作为一种良好的动物添加剂广泛应用于畜禽养殖业[4]。1998年我国将其批准为国家3 类新 兽药[5]，农业部公告第168号明确将那西肽作为饲料药物添加剂[6]。药物性添加剂长期或过量滥用及不遵循休药期使用，会对细菌耐药，且缓慢蓄积引起器官的功能紊乱，对动物及人类健康产生危害[7]。为保障动物性食品安全，农业部第278号公告中规定了那西肽鸡的休期为7 d，且产蛋期禁用[8]；其他国家如日本，规定了鸡和猪的肌肉、肝脏等组织那西肽的最高残留限量均为30 μg/kg[9]。近年来多肽类抗生素的残留逐渐受到关注，建立鸡蛋中那西肽残留的监测方法，对保障动物源性食品的安全具有重要意义。

目前报道的那西肽残留分析方法有高效液相色谱紫外检测法[10-11]、高效液相色谱荧光检测法[12-16]、气相色谱-质谱联用法[17]、液相色谱-串联质谱法[18]等，研究对象包括制剂、饲料、动物肌肉、肝脏和肾脏组织等[10-18]， 鸡蛋基质中那西肽的残留分析鲜见报道。由于那西肽禁止用于产蛋鸡，高效液相色谱法存在灵敏度较差、抗干扰能力不强、无法确证分析能力等缺点，难以满足鸡蛋中那西肽的残留要求；采用气相色谱-质谱测定，方法的前处理需进行衍生，操作复杂且稳定性较差。近年来，高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法检测方法在痕量分析中得到广泛应用[18-20]，特别是对于多肽类抗生素残留测定十分常见[21-25]，如王玉琴等[22]使用液相色谱-串联质谱法测定猪肉中万古霉素、去甲万古霉素和杆菌肽A，刘佳佳等[23]采用液相色谱-串联质谱法测定牛奶中5种多肽类抗生素。采用液相色谱-串联质谱法测定那西肽面临的一大困难是那西肽的碎片离子信号强度低[21]，难以直接测定；为此，Song Xuqin等[21]采用碱水解法通过间接分析那西肽的降解产物HMIA而实现了那西肽的液相色谱-串联质谱测定，该方法实验过程相对繁琐，且测定的目标物为降解产物而非那西肽原型，容易引起误判。目前鲜见那西肽液相色谱-串联质谱法直接测定的报道。因此，本实验建立那西肽HPLC-MS/MS直接测定法，并结合固相萃取技术实现鸡蛋中痕量那西肽的快速、灵敏、准确测定，旨在为鸡蛋中那西肽的残留监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋 市购。

甲醇、乙腈、正己烷、乙酸铵（均为色谱纯）， 二甲基亚砜（分析纯） 上海安谱实验科技股份有限 公司；甲酸（分析纯） 江苏永华化学股份有限公司；无水硫酸钠（分析纯） 上海国药集团化学试剂有限 公司；那西肽标准品（纯度77.6%） 广州硕谱生物科技有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

LCMS-8050型液相色谱-串联质谱仪、DGU-20A5R高效液相色谱仪 日本岛津公司；Accucore RP-MS色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm） 美国Fisher科 技公司；HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg，使用前用3 mL甲醇活化） 美国Waters公司；3K18型离心机 德国Sigma公司；5982-9120固相萃取装置 美国Agilent公司；TurboVap LV型氮吹浓缩仪 瑞典Biotage公司；EOFO-945066型漩涡混合器 美国Talkboys公司；0.22 μm聚四氟乙烯微孔滤膜 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取那西肽12.9 mg，用250 μL二甲基亚砜溶解，乙腈定容至50 mL，制得200 μg/mL标准储备溶液，-20 ℃避光保存，有效期为2个月。将质量浓度为200 μg/mL的标准溶液，用乙腈稀释为5 μg/mL的标准中间液，-20 ℃下避光保存，有效期为1个月。

1.3.2 样品处理

1.3.2.1 样品制备鸡蛋样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎，装入干净容器内，加封后做好标记，将试样于-20 ℃保存。

1.3.2.2 样品前处理

准确称取2 g（精确到0.01 g）均质试样，于50 mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入8 mL 1%甲酸-乙腈提取液，涡旋振荡10 min，9 500 r/min离心5 min，取上清液于另一50 mL离心管中，加入8 mL 1%甲酸-乙腈再次提取，涡旋振荡10 min，离心5 min，合并2 次提取液，加入水定容至20 mL，混合均匀。准确吸取10 mL混合提取液于15 mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入3 mL乙腈饱和正己烷，上下轻摇20 次，9 500 r/min离心5 min，收集乙腈层。收集液以1 s/滴的速率过HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，抽干，收集全部流出液。流出液中加入1 g无水硫酸钠，涡旋混合1 min，9 500 r/min离心5 min，静置分层，取上清液于15 mL刻度玻璃管中。将上清液50 ℃吹氮浓缩至0.5 mL左右，加入含2%甲酸的乙腈溶液定容至1 mL，混匀，过0.22 μm微孔滤膜，供HPLC-MS/MS测定。

1.3.3 检测条件

HPLC条件：Accucore RP-MS色谱柱（100 mm× 2.1 mm，2.6 μm）；柱温30 ℃；进样体积20 μL；流动相A：10 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B：乙腈；流速200 μL/min。梯度洗脱程序：0～1 min，70% A，30% B；1～5 min，流动相B线性增至90%，保持1 min；6.1～8 min，70% A，30% B。

MS条件：电喷雾离子源，负离子模式；碰撞气为氩气；多反应监测（multiple teaction monitoring，MRM）；雾化器流量3 L/min；加热气流量10 L/min；接口温度300 ℃；脱溶剂温度526 ℃；传输线温度250 ℃；加热块温度400 ℃；干燥气流量10 L/min；其他质谱参数见表1。

表1 那西肽质谱参数Table 1 Parameters of mass spectrometry for the determination of nosiheptide

1.4 数据处理

采用日本岛津公司的Labsolutions软件对检测数据进行处理，采用Excel软件对结果进行分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 提取溶液的选择

鸡蛋中含有大量的脂肪、蛋白质、不饱和脂肪酸等，基质复杂。乙腈具有极性适中、穿透力强的特点，常被用于样品中那西肽的提取[12-15]；此外，由于鸡蛋中含有大量蛋白质，采用乙腈进行提取可以快速将蛋白质变性，减少蛋白质的干扰。实验曾参考文献[12-15]采用纯乙腈作为提取溶剂，结果发现采用纯乙腈提取回收率低；考虑到溶液的酸碱性对样品提取效果有很大影响，因此实验进一步比较了1%甲酸-乙腈、1%氨水-乙腈及纯乙腈3种提取液对目标物的提取效率，结果如图1所示。在加标质量浓度为10 μg/kg条件下，3种不同提取溶液提取效率有明显差异。采用纯乙腈提取其回收率在40%以下；在乙腈中加入酸或碱，均能有效提升提取效率，加入1%氨水，回收率提升到60%左右；而加入1%甲酸，回收率提高到80%以上，这可能是加入甲酸酸化后，蛋白质的极性增加，从而减少了变性蛋白质对那西肽的吸附，因而提取效率得到显著提升。为进一步细化甲酸的用量，分别考察0.5%、1%、1.5%、2%和3%的甲酸溶液对目标物提取的影响，结果如图2所示。当甲酸溶液体积分数低于1.5%时，回收率较高，在90%以上；超过1.5%时，回收率逐步下降。因此，最终选用1%甲酸-乙腈作为提取溶液。

图1 不同提取液的提取效率Fig. 1 Effect of different extraction solvents on nosiheptide recovery

图2 甲酸体积分数对回收率的影响Fig. 2 Effect of formic acid concentration on nosiheptide recovery

2.2 净化条件的选择

乙腈提取液中含有部分油脂，实验采用正己烷对提取液进行脱脂，脱脂后的提取溶液呈浅黄色。为了进一步去除其中色素，实验通过固相萃取柱去除，分别比较HLB、C18两种固相萃取柱对回收率的影响。在加标量为10 μg/kg条件下，将提取液分别过2种不同固相萃取柱，考察其对回收率的影响。结果表明，2种固相萃取柱均具有较好的除色效果，过固相萃取液后提取液无色、透明、澄清；过柱后的回收率良好，C18的回收率为87%，HLB回收率为96%。因此，最终选择HLB固相萃取柱进行净化。

2.3 滤膜的影响

那西肽为多肽类物质，不同材料滤膜可能对回收率有较大影响。本实验将5 μg/L标准溶液，分别过聚四氟乙烯膜和聚酰胺有机膜2种不同类型微孔滤膜。结果表明采用聚四氟乙烯膜回收率为94%，而采用常规的聚酰胺有机滤膜回收率仅为63%，该结果表明常用的聚酰胺膜对那西肽有较强的吸附作用。因此，实验选择聚四氟乙烯材质滤膜。

2.4 测定条件的优化

取0.5 mg/L标准溶液，以流动注射的方式在负离子模式下进行一级质谱全扫描，得到那西肽的准分子离子峰（[M-H]-）m/z1 220，[M-H]-母离子再通过二级质谱全扫描，[M-H]-离子在碰撞池发生碎裂产生不同的碎片离子（图3），主要碎片有m/z1 176、1 017和973。Song Xuqin等[21]发现那西肽无论是采用电喷雾电离或大气压化学电离都只能得到低强度的碎片离子，本实验也发现当碰撞能量小于30 eV时，无法得到有效的碎片离子；但是，在较高碰撞能量（45 eV）条件下，那西肽能够通过碰撞得到多个明显的碎片离子，如图3所示。这可能是由于那西肽为环状多肽，分子结构较为稳定，且分子较大（相对分子质量超过1 000），因此需要较高碰撞能量才能碎裂。对得到的主要碎片离子进行解析，结果如图4 所示。发生碎裂的位置为酯基两侧和图中标示的C—S键处，准分子离子[M-H]-丢掉碎片a得到[M-H-a]-， 对应相对分子质量1 176；[M-H]-丢掉碎片b得到 [M-H-b]-，对应相对分子质量1 017；[M-H]-同时丢掉碎片a和碎片b得到[M-H-a-b]-，对应相对分子质量973。m/z973和m/z1 176丰度较高，故最终选择作为定量、定性离子。以MRM负离子模式优化碰撞电压、雾化器流量、加热气流量、脱溶剂温度、加热块温度、干燥气流量等各质谱参数，得到最佳质谱条件见表1。

图3 那西肽质谱图Fig. 3 MS/MS spectrum of nosiheptide

图4 那西肽质谱碎裂途径Fig. 4 Fragmentation pathways of nosiheptide

那西肽为多肽类抗生素，分子上带有多个氨基和羟基等极性基团，流动相的缓冲盐对其在色谱的保留及质谱响应有重要影响。常用的有机相有甲醇和乙腈，由于那西肽在乙腈中具有较好的溶解性，因此选择乙腈作为有机相。那西肽质谱检测采用负离子模式，中性或偏碱环境更有利于质谱负离子的产生，因此采用质谱检测中常用的醋酸铵溶液作为水相，该溶液能够将溶液pH值有效控制在中性条件。在相同梯度洗脱条件下考察2、5 mmol/L和10 mmol/L醋酸铵溶液对质谱响应的影响，结果如图5所示。该结果表明10 mmol/L醋酸铵作为水相时响应最高，即较高浓度的醋酸铵有利于质谱响应的提高，这主要是溶液中的醋酸根离子有助于负离子的产生[26-27]， 但高浓度的盐溶液容易在质谱锥孔沉积而导致堵塞，因此最终采用10 mmol/L醋酸铵作为水相。采用优化后的梯度洗脱条件，实现了5 min内那西肽的快速测定。

图5 醋酸铵水相质量浓度对质谱信号强度的影响Fig. 5 Effect of aqueous phase concentration of ammonium acetate on mass spectrometric signal intensity

2.5 基质效应

基质效应（matrix effect，ME）是与分析物共同洗脱并干扰质谱仪电离过程的基质物质引起的，导致检测信号的增强或抑制，可影响仪器的灵敏度和分析结果的准确性[28-29]。采用基质匹配和纯溶剂标准曲线，公式如下：ME/%=（S1/S2-1）×100。其中，S1为基质匹配标准曲线斜率；S2为纯溶剂标准曲线斜率。计算结果为负数，显示基质为抑制作用，为正数显示为增强作用。通常，|ME|≤10%时，基质效应可以忽略不计；|ME|在10%～20%之间，存在较弱的基质效应；|ME|＞20%，存在强基质效应[21,30]。考察本方法的基质效应，实验结果表明，那西肽化合物的ME为-67.3%，存在强基质抑制效应，因此，本研究在定量分析中采用基质匹配标准曲线。

2.6 方法的线性范围与检出限、定量限

在空白样品提取液中添加不同质量浓度的标准品（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L），采用本方法测定，以峰面积为纵坐标，对应质量浓度为横坐标进行线性拟合，绘制基质匹配标准曲线，那西肽在1.0～20.0 μg/L质量浓度范围内，线性关系良好，线性方程为y=710.936x-168.718，线性相关系数R2大于0.998。在最低添加水平下，以3 倍和10 倍信噪比结合浓度外推法确定方法的检出限和定量限，那西肽的检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。鸡蛋样品添加1.0 μg/kg的MRM色谱图如图6所示。

图6 鸡蛋中加标1.0 μg/kg那西肽的MRM色谱图Fig. 6 MRM chromatogram of egg samples spiked with 1.0 μg/kg nosiheptide

Song Xuqin等[21]采用液相色谱-串联质谱法通过测定那西肽碱水解产物4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸实现猪、鸡和鱼等动物组织中那西肽的测定，方法的定量限为2.0 μg/kg，回收率为85%～108%。与该方法相比，本方法通过对那西肽完整化合物进行HPLC-MS/MS分析，方法更为直接、简便，不容易导致假阳性，且灵敏度也更高。

2.7 样品测定

以不含有那西肽的鸡蛋样品作为空白样品，在空白鸡蛋样品中分别添加1.0、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg那西肽标准，每个添加水平平行测定6个样品，进行回收率和相对标准偏差检测，结果如表2所示。在添加量范围内，那西肽的平均回收率为83.8%～96.2%，相对标准偏差为6.0%～8.8%。陈慧华等[15]采用高效液相色谱法测定动物肌肉、肝脏组织中那西肽残留量，平均回收率为73.8%～93.0%，相对标准偏差为1.3%～11.1%；Song Xuqin等[21]采用液相色谱-串联质谱法测定猪、鸡和鱼等动物组织中那西肽残留，回收率为85%～108%；与两者相比，本方法的准确度基本处于同一水平。采集深圳地区不同超市的10 份鸡蛋样品采用本方法进行检测，未在样品中检出那西肽残留。

表2 鸡蛋中那西肽分析方法回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision (RSDs) for egg samples spiked at three different concentration levels (n = 6)

3 结 论

基于HPLC-MS/MS技术，建立那西肽的直接分析方法。样品经酸化乙腈提取，正己烷脱脂后采用固相萃取净化除杂，通过HPLC-MS/MS联用仪进行测定。本方法具有操作简便、灵敏度高、回收率好、具有确证能力等优势，能够满足我国法规对于鸡蛋中那西肽残留的监管要求，为鸡蛋中那西肽的检测提供了重要技术支撑。