青稞酒糟菌抑草活性的测定及活性菌株的鉴定

雷风兰，沈 硕*

(1.青海大学，青海 西宁 810016；2.青海省马铃薯育种重点实验室，青海 西宁 810016；3.青藏高原生物技术教育部重点实验室，青海 西宁 810016；4.西北马铃薯教育部工程研究中心，青海 西宁 810016)

杂草生长于田间时，会与农作物争夺肥料和空间等，使农作物产量和质量下降，并容易引发农作物虫害[1]，严重制约了现代农业的生产和发展。据统计，我国农作物常年受杂草严重危害的面积达4500×104hm2，直接造成的经济损失高达900多亿元[2]。化学除草剂以使用便捷、价格便宜、作用广泛、经济效益显著等优点被广泛应用于各种地区有效除去杂草。然而随着化学除草剂在田间长期大量的使用，造成了土壤污染和土质下降的后果[3]。同时杂草会产生抗药性，抗药性杂草快速生长和繁殖导致农田杂草危害更严重且更加难以治理[4]。微生物除草剂对目标杂草以外的植物影响小，环境负效应小，安全性高，往往具有广谱、低毒、低残留的特点，符合可持续农业的发展要求[5]。因此，利用分离筛选自然界中原有的微生物及其产生的含有生物活性的产物来研发新型生物防治除草剂已成为目前杂草治理研究中的热门领域，其对目标杂草专一性高，选择性强，而且具有改善土壤和环境的长期效益作用，对于促进现代农业生产的发展，具有极其重要的现实意义[6-8]。

酒糟菌糠含有大量营养物质包括蛋白质、氨基酸、微量元素、多糖、维生素和三萜等[9]，因此里面菌类丰富，具有极为特殊的生理结构和代谢机制，同时还产生了许多具有特殊性质的生物活性物质，对它的研究既具有理论意义，又有应用价值。

本研究以前期实验室成员从青海省互助青稞酒厂采集的青稞酒糟样品中分离到的酒糟菌菌株为对象，进行其抑制野燕麦种子萌发和幼苗生长的活性测定，对筛选到的活性酒糟菌株进行鉴定，研究结果为微生物源新型生物除草剂的开发提供新的菌株资源及理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

20株酒糟菌菌株由课题组成员前期从青海互助青稞酒厂采集的青稞酒糟样品中分离并保存至本实验室；野燕麦(AvenafatuaL.)种子由青海省农林科学院提供。

1.2 供试培养基

酒糟菌菌株培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。以不加琼脂的培养基为液体发酵培养基。

1.3 仪器

电子天平PL203(梅特勒—托利多仪器有限公司)，电热恒温干燥箱DHG-9240A(上海齐欣科学仪器有限公司)，循环水式多用真空泵SHB-B型(郑州长城科工贸有限公司)，立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KBS(上海申安医疗器械厂)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，全温摇瓶柜HYG-A(苏州培英实验设备有限公司)。

1.4 酒糟菌的活化

采用平板划线法，用接种环上蘸取少量平板中培养的酒糟菌在平板上自上而下连续划线，将接种后的培养基平板放置于35℃恒温培养箱中倒置培养48h。

1.5 酒糟菌发酵液的制备

用接种环蘸取一定量的酒糟菌，接种至装有牛肉膏蛋白胨液体发酵培养基的三角瓶中，将三角瓶放置于全温摇瓶柜中，在35℃下、以180r/min的转速震荡培养48h，收获酒糟菌发酵液。

1.6 酒糟菌抑制杂草活性的测定

选取大小一致、颗粒饱满的野燕麦种子，用4%的次氯酸钠溶液浸泡，同时用磁力搅拌器搅拌10min，再用无菌水搅拌冲洗3次(每次3min)，吸水纸吸干，25℃的条件下催芽24h[10]。挑选露白一致的供试种子进行测定。在高压灭菌后的玻璃培养皿(直径9cm)中铺双层滤纸，分别加入过滤好的不同酒糟细菌菌株发酵液5.00ml，以清水、空白培养液为CK对照。每皿放置露白一致的供试种子10粒，按3-4-3排列，每个处理3次重复。将培养皿放在25℃恒温培养箱中黑暗条件下培养3d，第4d开始培养箱内的光照周期为18L∶6D。培养期间加适量无菌水保持种子及幼苗生长所需要的水分。3d测定种子发芽率，种子发芽的标准为胚根突破种皮2mm，7d后同时测定根长、芽长、鲜质量、干质量并计算抑制率(%)[11]。试验采用完全随机试验设计。

抑制率Gr(%)=(供试杂草种子总数-杂草发芽种子数)/供试杂草种子总数×100

1.7 活性酒糟菌的分子生物学鉴定及系统发育树的构建

菌株DNA提取按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。PCR扩增体系：10Buffer 2.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶(5U/L)0.2μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和引物P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)(10 pmol/μl)各1μl，补水至25μl。反应条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 80s，共30个循环；72℃ 10min。PCR反应条件：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸75s，50μl反应体系30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将得到的16S rDNA序列在网站https://www.ezbio cloud.net/上进行序列对比，用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值为1000次)绘制系统发育进化树[12]。

1.8 统计分析

数据采用IBM SPSS Statistics 24.0进行分析，数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 酒糟菌菌株发酵液对野燕麦种子萌发的抑制作用

以20株酒糟菌发酵液对野燕麦种子进行发芽率抑制作用的实验。由表1可知，菌株JZ1-1-9对野燕麦种子萌发的抑制活性最高，抑制率为100.00%，与对照差异显著(图1a-图1c)。菌株JZ2-2-1、JZ3-1-6、JZ3-4-7、JZ3-2-5、JZ3-1-10对野燕麦种子萌发的抑制活性较高，抑制率分别为77.00%、73.00%、70.00%、70.00%、70.00%，与对照相比差异显著(图1a，1b，1d，1e，1f，1g，1h)。

表1 不同菌株对野燕麦发芽率的影响Table.1 The influence of difference strains on germination rate of A.fatua L.

注：a为空白对照；b为清水对照；c为菌株JZ1-1-9发酵液对野燕麦种子萌发的影响；d为菌株JZ2-2-1发酵液对野燕麦种子萌发的影响；e为菌株JZ3-1-6发酵液对野燕麦种子萌发的影响；f为菌株JZ3-4-7发酵液对野燕麦种子萌发的影响；g为菌株JZ3-2-5发酵液对野燕麦种子萌发的影响；h为菌株JZ3-1-10发酵液对野燕麦种子萌发的影响。图1 不同菌株对野燕麦种子萌发的影响Fig.1 The influence of difference strains on the germination of A.fatua L.

2.2 酒糟菌菌株发酵液对野燕麦幼苗生长的影响

20株酒糟菌发酵液对野燕麦的芽长、根长、鲜质量、干质量均有不同程度的抑制作用(表2)。对芽长和根长抑制效果最强的为菌株JZ1-1-9，抑制率均为100.00%；对鲜质量抑制效果最强的为菌株JZ1-1-9和JZ2-4-15，抑制率均为76.50%(a，b，c，d，e)。

表2 20株酒糟菌发酵液对野燕麦种子幼苗生长的作用Table.2 Effect of 20 strains from distiller’s grain on growth of A.fatua L.

注：a为清水对照；b为空白对照；c为菌株JZ1-1-9发酵液对野燕麦幼苗生长的影响；d为菌株JZ2-2-1发酵液对野燕麦幼苗生长的影响；e为菌株JZ 2-4-15发酵液对野燕麦幼苗生长的影响图2 不同菌株对野燕麦幼苗生长的影响Fig.2 The influence of different strains on growth of A.fatua L

2.3 活性菌株的分子生物学鉴定

通过对抑制杂草生长的活性酒糟菌进行筛选的结果表明：20株供试酒糟菌中，菌株JZ1-1-9、JZ2-2-1和JZ2-4-15对野燕麦种子萌发及幼苗生长的抑制效果明显。对上述3株活性酒糟菌菌株进行分子生物学鉴定。

将3株活性酒糟菌16S rDNA序列的测序结果在https://www.ezbiocloud.net /identify网站上进行比对，选择相似性在99%以上的序列，用MEGA 7.0软件绘制系统发育树(图3、图4、图5)。结果表明，与菌株JZ1-1-9、JZ2-4-15和JZ2-2-1同源性达到99%的均为芽孢杆菌属(Bacillussp.)。确定菌株JZ1-1-9和JZ2-4-15为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、菌株JZ2-2-1为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。

图3 菌株JZ1-1-9的系统发育树Fig.3 Phyloginetic tree of strain JZ 1-1-9

图4 菌株JZ2-2-1的系统发育树Fig.4 Phyloginetic tree of strain JZ2-2-1

3 讨论与结论

本研究通过20株酒糟菌发酵液对野燕麦的种子萌发和幼苗生长的影响试验发现：菌株JZ1-1-9发酵液对野燕麦的种子萌发具有最显著的抑制作用；同时，菌株JZ1-1-9发酵液对野燕麦芽长和根长也具有显著的抑制作用；菌株JZ2-4-15和JZ1-1-9对野燕麦的鲜质量抑制效果最强。经鉴定，菌株JZ1-1-9和JZ 2-4-15为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，菌株JZ 2-2-1为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。这3株活性菌株可为生物源除草剂的开发提供理论依据。

21世纪以来，很多研究人员开始生物防治研究，对生防菌抑草的前景及存在的问题各国进行了研究，目前防止杂草主要依靠化学防治，但存在盲目用药及3R[13]问题，降低化学药剂的防治的防治效果。因此，对生态环境及人体无害的生防菌剂替代化学试剂，已经成为世界范围内病、虫、草防治的发展方向。常见的生防菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus siamensis)又称暹罗芽胞杆菌，目前已有相关研究表明其对由镰刀菌属所引起赤霉病和腐烂病具有显著的抑制效果，且通过产生蛋白类生物表面活性剂达到抑制目的[14-18]。但有关西姆芽孢杆菌对杂草进行防治的研究在国内还未见报道。目前短小芽孢杆菌的生防研究主要集中于草莓尖胞镰刀菌、马铃薯炭疽病菌和水稻立枯丝核菌等植物病原真菌的拮抗研究以及代谢产物和微生态制剂的制备[19-22]。但关于抑草活性物质的探索以及机制机理需要进一步的研究。下一步我们拟针对3株活性菌株进行次级代谢产物的分离及作用机理的深入研究，以加快推进新型生物除草剂的应用进程。