MiR-24对肺癌A549细胞增殖和迁移的影响

杜娟，严馨，邱丽，易静叶，阳甜

(西安交通大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，陕西 西安 710061)

肺癌是世界范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤疾病[1]，截止2013年我国的肺癌发生率和病死率均居恶性肿瘤首位，严重威胁人类的生命健康[2]。其中，非小细胞肺癌作为肺癌的常见亚型，约占所有病例的85%，传统的化疗药物虽然可有效延长患者的生存期，但治疗副作用较大，严重时还会危及患者生命[3-4]。微小核糖核酸24(micro ribonucleic acid 24，MiR-24等微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)作为机体内的癌基因或抑癌基因，可通过抑制细胞因子的表达调控细胞的凋亡和分化过程，进而影响宫颈癌、胆管癌等多种恶性肿瘤疾病的发生和进展[5-7]。异常表达的MiR-24在恶性肿瘤疾病的发生和发展过程中发挥出了“致癌”或“抑癌的作用”，甚至在恶性肿瘤疾病的放化疗治疗中也发挥出了一定的作用。然而，临床中针对其在肺癌细胞中的影响研究却相对较少，且其作用机制尚不明确。本研究分析MiR-24对肺癌A549细胞增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制，期望为肺癌的靶向治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人肺癌A549细胞购于中国科学院细胞库；细胞培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清 [赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，台盼蓝染色检测试剂盒(上海碧云天)，噻唑蓝 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT](上海碧云天)，兔抗基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)(美国Abcam公司)，兔抗基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)(美国Abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(美国Abcam公司)，TUNEL染色试剂盒(上海碧云天)，青霉素/链霉素双抗(美国Gibco公司)，MiR-24拟似物(CATGAGGGCAGAAACCGATGCAA)和MiR-24抑制物(GTTGCATCGGTTTCTGCCCTCATG)由广州锐博生物有限公司合成，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海碧云天)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(上海碧云天)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将人肺癌细胞A549放入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的双抗细胞培养基中，并将其放置于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱(山东博科生物产业有限公司，QP-50)内培养，待细胞长满约90%时进行传代，培养后取对数生长的细胞用于实验。将加入MiR-24拟似物的细胞作为观察组，加入MiR-24抑制物的细胞作为抑制组，另设空白对照作为对照组。

1.2.2 MTT检测细胞增殖能力 将人肺癌A549细胞接种于1×104/孔的96孔板(赛默飞世尔科技有限公司)内，12 h后分别转染MiR-24拟似物和抑制物，分别作为观察组和抑制组，另设空白对照组，并在处理后分别于0、12、24和48 h各个不同时间段分别加入MTT，于37 ℃条件下孵育4 h，随后加入100 μL DMSO，震荡15 min后于490 nm处测量吸光值(optical density，OD)，以反映细胞增殖活力。OD490值越高，细胞的活力越高。平行试验3次。

1.2.3 划痕实验检测细胞迁移能力 将处理后的人肺癌A549细胞接种于6孔板内，每孔3 mL，待细胞生长至90%融合后使用200 μL的吸头在孔板内垂直划痕，使用磷酸盐缓冲液(PBS)对清洗3次后，将A549细胞分为3组，分别加入无血清培养基(对照组)、MiR-24拟似物(观察组)和抑制物(抑制组)继续培养，每组设立2个复孔，培养时间均为24 h。分别于实验0 h和24 h于光学显微镜下观察划痕伤口的宽度并做好记录，计算创面的愈合率作为细胞迁移能力的判定依据。创面愈合率=(1-24 h创面宽度/0 h创面宽度)×100%[8]。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭能力 将对数生长的人肺癌A549细胞接种于Transwell小室中，每孔密度为1×105，终体积为200 μL，将600 μL的无血清培养基加入至下室内，待12 h后更换培养基，将A549细胞分为3组，分别加入无血清培养基(对照组)、MiR-24拟似物(观察组)和抑制物(抑制组)继续培养，每组设立2个复孔。转染24 h后，使用棉签将上层细胞擦去，使用浓度为95%的乙醇溶液固定20 min后，使用4%的台盼蓝染色20 min，于200倍的显微镜下观察实验结果，每个小室随机抽取6个视野拍照并计算穿膜细胞个数。

1.2.5 Western blot检测相关蛋白的表达水平 细胞处理24 h后进行收集，裂解后再次收集细胞总蛋白，取等量的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后将其转印至聚偏氟乙烯(poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF)膜上，使用含有5%脱脂奶粉的封闭液将其封闭60 min，随后加入兔抗MMP-2(1∶2 000)、兔抗MMP-9(1∶4 000)和鼠抗β-actin(1∶8 000)，于4 ℃的条件下反应8 h，使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶10 000)于室温条件下反应60 min，以GAPDH作为内参照，使用凝胶分析软件进行分析，观察内参泳道灰度及目的条带之间的比值作为蛋白相对表达水平。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)检测相关mRNA表达 利用qPCR法针对人肺癌A549细胞中的MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平进行检测，采用TRizol法提取细胞总RNA后进行逆转录反应，反应条件为：37 ℃条件下反应15 min，98 ℃条件下反应5 min，反应结束后将cDNA稀释至5倍，放置于-20 ℃的条件下保存，随后使用检测试剂盒(天根生化科技有限公司)配置反应体系并在PCR仪(赛默飞世尔科技有限公司)上进行反应，反应条件为：95 ℃条件下15 min，95 ℃条件下10 s，62 ℃条件下10 s，共计反应40个循环后，使用仪器自带的程序分析溶解曲线。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MiR-24对肺癌A549细胞增殖的影响

0 h时，观察组和抑制组的OD490值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；在12、24和48 h，观察组的OD490值低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 MiR-24对肺癌A549细胞增殖的影响

2.2 MiR-24对肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响

单因素ANOVA分析结果显示，各组间的迁移细胞数、侵袭细胞数和愈合率比较，观察组<对照组<抑制组，且组间三项指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1和图2。

2.3 MiR-24对肺癌A549细胞相关蛋白表达的影响

单因素ANOVA分析结果显示，MMP-2和MMP-9蛋白表达水平比较，观察组<对照组<抑制组，组间两项指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3和图3。

表2 MiR-24对肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响

表3 MiR-24对肺癌A549细胞相关蛋白表达的影响

2.4 MiR-24对肺癌A549细胞相关mRNA表达的影响

单因素ANOVA分析结果显示，MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平比较，观察组<对照组<抑制组，组间两项指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 MiR-24对肺癌A549细胞相关mRNA表达的影响

3 讨论

肺癌是目前导致癌症相关性死亡的常见病因，每年有180万的肺癌新发病例，且有160万人因肺癌死亡[9]，而肺癌患者的5年生存率仅有4%～17%[10]。临床中，针对肺癌患者的治疗方式包括手术治疗、药物治疗和放射干预治疗等，随着近年来临床治疗水平的不断提升，各种治疗方式虽取得了一定的进步，但肺癌患者的远期生存率仍相对较低，因此迫切需要一种更加有效的治疗手段[11]。近年来，大量临床研究[12-15]发现miRNA广泛存在于人体的体液、组织以及血液当中，在肿瘤的发生、发展以及预后中至关重要，由于其可在血清中稳定存在，且具有一定的重复性，因此在临床中有较好的应用价值[12]。譬如，MiR-21、MiR-34和MiR-23等多种miRNA均在肺癌组织中存在明显的表达异常，对肺癌的发生和发展有重要作用[13-15]。

MiR-24在人体多种组织内广泛存在，可调控细胞的生长发育和增殖、凋亡，但其在不同细胞内对细胞的增殖和凋亡调控作用却并不相同[16-17]。本研究发现观察组在12 h、24 h和48 h的细胞增殖率低于抑制组(P<0.05)，观察组的迁移细胞数、侵袭细胞数和愈合率均低于对照组和抑制组(P<0.05)，且对照组低于抑制组(P<0.05)，说明MiR-24过表达可有效抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与既往研究[18]结果相似。

MMP是一种内肽酶，可降解大部分的细胞外基质成分，具有促进肿瘤细胞突破组织屏障，侵袭邻近组织的能力[19]。MMP-2和MMP-9在许多肿瘤组织中均有所表达，不仅影响肿瘤细胞的组织屏障及其侵袭邻近组织的能力，且对肿瘤细胞的黏附能力也可以产生一定的作用[20]。本研究发现，MMP-2、MMP-9蛋白以及两者mRNA的表达比较，观察组>对照组>抑制组(P<0.05)，提示MiR-24可能通过对MMP-2和MMP-9表达水平的调控，进而对肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力产生抑制作用。

综上所述，MiR-24可有效抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭，且其作用机制与对MMP-2和MMP-9蛋白表达的下调有关。