基于网络药理学及分子对接研究益气养阴清热方治疗2型糖尿病的作用机制

胡洲映 李双蕾 陈远瑾 覃海恋 宋石开 胡飞

摘要 目的：運用网络药理学及分子对接预测益气养阴清热方治疗2型糖尿病的作用机制。方法：借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、BATMAN-TCM数据库获取益气养阴清热方6味中药的化学成分和作用靶点。通过GeneCards数据库获取治疗2型糖尿病相关靶点;利用R软件获取有效成分与疾病相关靶点之交集;利用Cytoscape v3.8.0中CytoHubba插件筛选出核心靶点，利用ClueGo插件对核心靶标进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。借助AutoDockTool、Vina、Pymol软件，将进行预处理及分子对接。结果：本研究共获取养阴清热方相关有效成分70个，活性成分所涉及的相关靶点222个，有槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素、芒柄花黄素等;对13个核心靶点进行GO生物过程、KEGG富集分析分别得到36条和47条结果，主要与对脂多糖的反应，对缺氧的反应，对氧化应激的反应相关，涉及IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。分子对接结果显示核心成分与核心靶点JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14、ESR1、CXCL8对接良好。结论：益气养阴清热方可通过多途径、多靶点、多通道影响调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗、抑制肝糖异生、降低炎症反应、保护血管内皮、改善胰岛B细胞分泌功能、调节免疫反应等途径治疗2型糖尿病。

关键词 网络药理学;分子对接;益气养阴清热方;2型糖尿病

Mechanism of Yiqi Yangyin Qingre Formula in Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

HU Zhouying1，LI Shuanglei2，CHEN Yuanjin1，QIN Hailian1，SONG Shikai1，HU Fei1

（1 Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China; 2 The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Yiqi Yangyin Qingre Formula（YQYYQR） on type 2 diabetes mellitus（T2DM） by network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP and BATMAN-TCM were used to obtain the chemical constituents and action targets of six Chinese medicinal drugs in YQYYQR.The targets related to the treatment of T2DM were obtained from GeneCards.The common targets were obtained by the R programming language.The core targets were screened out by CytoHubba plug-in in Cytoscape v3.8.0.The core targets were analyzed for Go and KEGG enrichment analyses by the ClueGo plug-in.AutoDockTool，Vina，and Pymol were used for pretreatment and molecular docking.Results：Seventy active constituents of YQYYQR were obtained，and 222 targets were involved in the active constituents，such as quercetin，kaempferol，luteolin，wogonin，and miscanthin.As revealed by GO and KEGG enrichment analyses of 13 core targets，36 entries of biological processes，such as responses to lipopolysaccharide，hypoxia，and oxidative stress，and 47 entries of pathways，such as IL-17 signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，Toll-like receptor signaling pathway，and tumor necrosis factor signaling pathway，were obtained.The results of molecular docking showed that the core constituents showed good affinity with the core targets JUN，AKT1，MAPK1，TP53，IL6，MAPK14，ESR1，and CXCL8.Conclusion：YQYYQR can treat T2DM by regulating glucose and lipid metabolism，improving insulin resistance，inhibiting hepatic gluconeogenesis，reducing inflammatory reaction，protecting vascular endothelium，improving islet β-cell secretion，and mediating immune response through multiple channels，multiple targets，and multiple pathways.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Yiqi Yangyin Qingre Formula; Type 2 diabetes mellitus

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.002

随着人口老龄化的上升及生活方式的转变，糖尿病患病率呈迅猛增加的趋势，据统计，2013年发达国家2型糖尿病（T2DM）的患病率为1.2%，而发展中国家的患病率被认为已是其4倍以上[1-2]。T2DM是一组常见的以血糖增高为主要特征的糖、蛋白类、脂肪物质代谢紊乱的各系统损害的一种内分泌疾病，是由于人体内胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗而引发的[3]。糖尿病作为慢性代谢性疾病，已成为威胁老年人健康的重大公共卫生问题，其致残率和病死率高，对我国的医疗卫生造成了极大的负担。

中医认为，T2DM属“消渴”“消瘅”等中医范畴，阴虚燥热为其基本病机。《证治要诀·三消》有云：“三消得之气之实，血之虚，久久不治，气尽虚，则无能为力矣。”《儒门事亲·三消之说当从火断》指出：“夫一身之心火，甚于上为膈膜之消;甚于中，则为肠胃之消;甚于下，为膏液之消;甚于外为肌肉之消。”因而“虚”“热”论治在发病过程当中起着关键作用。李双蕾等[4]认为在消渴其发病机制中，当属气阴亏虚，热毒为患为要，并根据多年治疗糖尿病的临床经验，精选药物组成益气养阴清热方，该方由生黄芪、黄连、知母、麦冬、连翘、淮山药组成。方中重用黄芪为君，其性甘温，入脾胃经，补中益气。山药补脾益阴，滋肾固精，黄连清热解毒，燥湿坚阴，二者为臣;知母苦寒质润，泻三焦虚火，滋阴润燥，麦冬助知母养阴清热生津，二者相和，共为佐药;连翘清热解毒，散结消肿，一清热毒，二防补益太过，聚而为毒，为佐使之用。全方共奏益气养阴，清热解毒之效。

在前期研究发现，益气养阴清热方（YiQiYangYinQingReFang，YQYYQRF）能改善血糖、胰岛素抵抗，降低炎症介质水平等途径调控血糖[4-6]。结合前期研究，本研究运用网络药理学方法，整合分析数据库中药有效成分与疾病的信息，对中药复方潜在治疗靶点进行预测，进一步探究益气养阴清热方治疗T2DM的作用机制。

1 资料与方法

1.1 筛选益气养阴清热方有效成分及靶点获取   通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）获取益气养阴清热方中生黄芪、黄连、知母、麦冬、连翘、淮山药的有效成分，按照口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18的条件对有效成分进行筛选。在TCMSP中Related Targets标签获取各有效成分的靶点，并对所有中药的有效成分、有效成分对应的靶点、有效成分对应的中药名进行整合。利用Cytoscape 3.8.0软件构建“中药-活性成分-靶点”网络图。

1.2 靶点基因注释 将检索获取的中药有效成分作用靶点，通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）校进行靶点基因注释。

1.3 T2DM靶点的获取 运用GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库进行T2DM疾病靶点的选取，输入“Type 2 Diabetes Mellitus”进行检索，得到相关靶点。

1.4 获取基因交集靶点 利用R软件，对成分相关的靶点与疾病相关靶点取交集，并将筛选到的交集靶点上传至在线韦恩图网站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到活性化合物与疾病的交集基因。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络 将交集靶点导入到STRING数据库（https：//string-db.org/），选定“Homo Sapiens”物种，试验将置信度评分设置为>0.9（Highest Confidence），并选择隐藏PPI网络中断开连接的节点（Hide Disconnected Nodes in The Network），其余参数默认，构建交集靶点相互作用网络拓扑。利用Cytoscape 3.8.0软件中CytoHubba插件計算网络中每个节点的拓扑参数（介数、自由度、接近中心性、平均最短路径长度），并以所有节点这4个参数的中值作为筛选条件。当4个参数均大于中值的节点时被认为是PPI网络中起核心作用的主要枢纽。

1.6 富集分析 利用Cytoscape 3.8.0软件中GlueGO插件对核心靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG） 富集分析。设定P<0.05，并采用Bonferroni法进行校正，Kappa Score默认为0.4。

1.7 分子对接 通过以上结果分析，筛选出调控核心成分及核心靶点，用于分子对接的活性成分及靶点，并从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子化合物结构，RCSB PDB（http：//www.rcsb.org/）数据库下载相关靶点的蛋白结构，利用Auto Dock软件去除水分子、氢等处理，运用AutoDock MGL Tools 1.5.6、Pymol 2.6、AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接模拟获取对接能量。

2 结果

2.1 潜在活性成分的筛选和作用靶点预测 益气养阴清热方有效成分70个，其中黄芪16个，黄连10个，知母11个，连翘19个，山药12个，麦冬1个。有效成分所对应的靶点258个。“中药-活性成分-靶点”网络中对应靶点最多的有效成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素、芒柄花黄素，分别为对77个、33个、29个、22个、16个。见图1。

2.2 疾病靶点筛选与共同靶点PPI构建 通过GeneCard以“Type 2 Diabetes Mellitus”作为关键词搜索T2DM相关靶点1 786个（已去掉重合基因）。将1 786个疾病靶点与222个益气养阴清热方有效成分作用靶点交集靶点119个。见图2。将靶点导入STRING建立PPI网络。见图3。利用Cytoscape 3.8.0软件中CytoHubba插件计算出核心靶点共13个。见表1。

2.3 富集结果分析 13个交集靶点GO生物过程（Biological Process，BP）得到36条通路。见图4。生物过程富集结果主要包括RNA聚合酶Ⅱ对pri-miRNA转录的调控、白细胞趋化调节、RNA聚合酶Ⅱ对pri-miRNA转录的正调控作用、细胞对镉离子的反应、内质网核信号通路等。KEGG富集分析结果共47条通路。调高P值至P≤0.01，Pathway Selection为6%，得到16条通路，主要涉及IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。见图5。

2.4 益气养阴清热方核心靶点通路网络构建 利用Cytoscape 3.8.0软件，构建益气养阴清热方核心靶点—通路网络。见图6。图6可见益气养阴清热方可通过多靶点作用于JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等多个靶点并干预AGE/RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。

2.5 益气养阴清热方主要成分与AKT1、STAT3、JUN的分子对接认证 选取“中药-有效成分-靶标-通路”网络图中度值高于平均值的4个化合物（槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素、芒柄花黄素）与核心靶点（JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14）进行分子对接模拟，一般认为其绝对值大于5的时候，小分子和蛋白二者结合的可能性较大[7]。见表2，图7。结果提示益气养阴清热汤的核心成分均与JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等关键靶点有较好的亲和力。

3 讨论

目前针对T2DM的研究主要围绕肥胖相关的胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷以及通过B细胞凋亡导致的B细胞质量下降等几个方面的病理改变展开，并与炎症改变、免疫基因缺陷和线粒体功能受损等具有密切联系[8-9]。以此将对网络药理学分析结果即益气养阴清热方治疗T2DM的潜在机制结果及潜在药效物质和关键靶点分子对接结果进行讨论。

3.1 活性成分及靶标 本研究利用网络药理学从多基因、多通络、多靶点进行整体分析，得出益气养阴清热方治疗T2DM的有效成分70个，核心主要有：槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素、芒柄花黄素。槲皮素是多种中草药中黄酮类化合物，益气养阴清热方中，连翘、黄芪、黄连中均含有槲皮素，其具有良好的生物学价值，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，有研究表明，槲皮素可较好地改善糖脂代谢紊乱及保护胰岛功能，其机制可能与干预AKT信号通路及上调SIRT1的活性和蛋白水平有关[10]。槲皮素亦能通过抑制炎症途径，特别是核因子κB信号转导，具有预防糖尿病血管并发症的潜在作用[11]。研究发现，山柰酚抑制肝糖异生，其机制可能与干预肝脏AKT信号相关[12]。木犀草素可降低PKB/AKT、PRAS40-、p70S6K-和S6的磷酸化，从而降低肝葡萄糖生成）和减少肝脏脂肪变性[13]。汉黄芩素对T2DM小鼠视网膜病变有一定改善作用，并能阻断高血糖诱导的血管炎症的发生，其机制可能与抗氧化、增加核因子κB的活化、CAMs的表达、保护内皮屏障功能的破坏等相关[14-15]。研究表明芒柄花青素能显著提高胰岛素敏感性指数，降低HOMA-IR，改善胰岛素抵抗，其机制可能与增加SIRT1的表达有关[16]。

3.2 PPI网络拓扑分析

CytoHubba分析结果看出，核心靶点有JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等。c-Jun N-Terminal Kinases（JUKS）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的成员，肥胖引起的慢性炎症激活JNK及其相关通路，导致糖、脂代谢受损，阻断胰岛素信号转导，降低胰岛素靶细胞的胰岛素敏感性[17-18]。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K-AKT信号通路中的关键蛋白。其磷酸化与糖、脂代谢密切相关[19]。研究发现，MiR-423-5p通过抑制肝脏中FAM3A-ATP-AKT通路，促进肝脏糖异生和脂质沉积，并诱导葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和高血糖。功能失调的AKT会导致糖脂代谢紊乱[20]。

MAP激酶又称细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal Regulated Kinases，Erks）是多种生化信号的整合点，参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等多种过程[21]。过量摄入热量可导致T2DM样疾病小鼠脂肪组织中氧化应激的积累，并促进衰老样改变，从而导致TP53表达增加和炎症介质生成增加[22]。研究表明IL-6与胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍有密切相关[23]。

3.3 富集结果分析 KEGG通路富集结果中，较为关键的是IL-17信号通路、AGE/RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。研究表明，T2DM可能是一种由细胞因子介导的先天免疫性疾病和炎症反应，炎症介质的释放是诱导发生胰岛素抵抗以及影响胰岛素分泌的重要因素[24]。白细胞介素-17（IL-17）家族是由IL-17A-F组成的细胞因子亚群，在急性和慢性炎症反应中起着至关重要的作用[25]。肥胖相关2型糖尿病患者的T细胞炎症的特征是循环Th17细胞数量增加，Th17衍生细胞因子产生增加，Th17标志基因激活，此外，T2DM患者血浆DPP4活性的增加与循环Th17细胞DPP4的分泌增强有关，因而IL-17信号通路在糖尿病炎症反应中起着重要作用[26-27]。AGEs/RAGE信号通路是导致糖尿病多种组织细胞损伤的重要机制，其可诱导下游不同的信号通路，如JAK/STAT、PKC/PI3K/AKT、MAPK/Erk和Src/RhoA/Cdc42等，它们可激活各种转录因子，参与炎症的基因转录，与糖尿病微血管和大血管并发症发病密切相关[28]。

綜上所述，我们推测益气养阴清热汤可能通过作用于IL-17信号通路、AGE/RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路在T2DM的治疗中发挥调控血糖，改善胰岛素抵抗，调节免疫，抑制炎症反应等作用。因而选择通路中的关键靶点与益气养阴清热汤关键有效成分进行分子对接以分析它们之间的亲和力进一步论证。

3.4 分子对接预测结果 分子对接是计算蛋白质-配体相互作用最广泛的方法，本研究结果提示，益气养阴清热汤的核心成分均与JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等关键靶点有较好的亲和力，佐证其有可能通过作用于以上几种关键靶点而治疗T2DM。

前期研究和临床观察已证实益气养阴清热方在治疗T2DM中具有可观的临床疗效。本研究运用网络药理学与分子对接技术，预测益气养阴清热方治疗T2DM的起效机制，挖掘其潜在作用机制，研究结果得出益气养阴清热方通过多成分，多靶点，多通路调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗、抑制肝糖异生、降低炎症反应、保护血管内皮、改善胰岛B细胞分泌功能、调节免疫反应等途径治疗T2DM，并为后续的益气养阴清热方药理机制提供了生物学研究的依据。本研究以数据挖掘和数据分析为基础的预测性研究，具有一定的局限性，因而亟须通过进一步基础研究进行验证，并积极回归临床，更好地发挥中医药的优势。

参考文献

[1]Garber AJ，Handelsman Y，Einhorn D，et al.Diagnosis and management of prediabetes in the continuum of hyperglycemia：when do the risks of diabetes begin？ A consensus statement from the American College of Endocrinology and the American Association of Clinical Endocrinologists[J].Endocr Pract，2008，14（7）：933-946.

[2]Guariguata L，Whiting DR，Hambleton I，et al.Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035[J].Diabetes Res Clin Pract，2014，103（2）：137-149.

[3]Kharroubi AT，Darwish HM.Diabetes mellitus：The epidemic of the century[J].World J Diabetes，2015，6（6）：850-867.

[4]李双蕾，陈莉娜，赵伟，等.益气养阴清热方对2型糖尿病患者炎症因子的影响[J].中华中医药杂志，2013，28（3）：746-748.

[5]李双蕾，陈文辉，陈莉娜，等.益气养阴清热方对初发2型糖尿病患者胰岛素抵抗的影响[J].广西中医药，2012，35（4）：9-12.

[6]蒋云霞，陈文辉，李双蕾，等.益气养阴清热方对KKAy小鼠GLP-2、IFN-γ、NF-κB的影响[J].湖南中医药大学学报，2019，39（6）：704-707.

[7]Morris GM，Huey R，Lindstrom W，et al.AutoDock4 and AutoDockTools4：Automated docking with selective receptor flexibility[J].J Comput Chem，2009，30（16）：2785-2791.

[8]Surapon Tangvarasittichai.Oxidative stress，insulin resistance，dyslipidemia and type 2 diabetes mellitus[J].World J Diabetes，2015，6（3）：456-480.

[9]Tomita T.Apoptosis in pancreatic beta-islet cells in Type 2 diabetes[J].Bosn J Basic Med Sci，2016，16（3）：162-179.

[10]Peng J，Li Q，Li K，et al.Quercetin Improves Glucose and Lipid Metabolism of Diabetic Rats：Involvement of Akt Signaling and SIRT1[J].J Diabetes Res，2017，2017：3417306.

[11]Mahmoud MF，Hassan NA，El BH，et al.Quercetin protects against diabetes-induced exaggerated vasoconstriction in rats：effect on low grade inflammation[J].PLoS One，2013，8（5）：e63784.

[12]Alkhalidy H，Moore W，Wang A，et al.Kaempferol ameliorates hyperglycemia through suppressing hepatic gluconeogenesis and enhancing hepatic insulin sensitivity in diet-induced obese mice[J].J Nutr Biochem，2018，58：90-101.

[13]Bumke-Vogt C，Osterhoff MA，Borchert A，et al.The flavones apigenin and luteolin induce FOXO1 translocation but inhibit gluconeogenic and lipogenic gene expression in human cells[J].PLoS One，2014，9（8）：e104321.

[14]Ku SK，Bae JS.Baicalin，baicalein and wogonin inhibits high glucose-induced vascular inflammation in vitro and in vivo[J].BMB Rep，2015，48（9）：519-524.

[15]侯亚莉，林梅，梅稳，等.汉黄芩素对2型糖尿病小鼠糖尿病视网膜病变改善作用[J].中华中医药学刊，2019，37（10）：2398-2400.

[16]Oza MJ，Kulkarni YA.Formononetin Treatment in Type 2 Diabetic Rats Reduces Insulin Resistance and Hyperglycemia[J].Front Pharmacol，2018，9：739.

[17]Vogt PK.Fortuitous convergences：the beginnings of JUN[J].Nat Rev Cancer，2002，2（6）：465-469.

[18]Feng J，Lu S，Ou B，et al.The Role of JNk Signaling Pathway in Obesity-Driven Insulin Resistance[J].Diabetes Metab Syndr Obes，2020，13：1399-1406.

[19]Wang Y，Dang N，Sun P，et al.The effects of metformin on fibroblast growth factor 19，21 and fibroblast growth factor receptor 1 in high-fat diet and streptozotocin induced diabetic rats[J].Endocr J，2017，64（5）：543-552.

[20]Yang W，Wang J，Chen Z，et al.NFE2 Induces miR-423-5p to Promote Gluconeogenesis and Hyperglycemia by Repressing the Hepatic FAM3A-ATP-Akt Pathway[J].Diabetes，2017，66（7）：1819-1832.

[21]Cao S，Han X，Ding C，et al.Molecular cloning of the duck mitogen-activated protein kinase 1（MAPK1） gene and the development of a quantitative real-time PCR assay to detect its expression[J].Poult Sci，2014，93（9）：2158-2167.

[22]Minamino T，Orimo M，Shimizu I，et al.A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance[J].Nat Med，2009，15（9）：1082-1087.

[23]Bertoni AG，Burke GL，Owusu JA，et al.Inflammation and the incidence of type 2 diabetes：the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis（MESA）[J].Diabetes Care，2010，33（4）：804-810.

[24]Oguntibeju OO.Type 2 diabetes mellitus，oxidative stress and inflammation：examining the links[J].Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2019，11（3）：45.

[25]Hymowitz SG，Filvaroff EH，Yin JP，et al.IL-17s adopt a cystine knot fold：structure and activity of a novel cytokine，IL-17F，and implications for receptor binding[J].EMBO J，2001，20（19）：5332-5341.

[26]Zapata-Gonzalez F，Auguet T，Aragones G，et al.Interleukin-17A Gene Expression in Morbidly Obese Women[J].Int J Mol Sci，2015，16（8）：17469-17481.

[27]Nargis T，Kumar K，Ghosh AR，et al.KLK5 induces shedding of DPP4 from circulatory Th17 cells in type 2 diabetes[J].Mol Metab，2017，6（11）：1529-1539.

[28]Litwinoff E，Hurtado DPC，Ramasamy R，et al.Emerging Targets for Therapeutic Development in Diabetes and Its Complications：The RAGE Signaling Pathway[J].Clin Pharmacol Ther，2015，98（2）：135-144.

（2020-12-24收稿 本文編辑：魏庆双）