高效液相法测定蜂蜜中甘油的含量

杨 娟

上海工微所科技有限公司， 上海 200233

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]。常温下蜂蜜呈半透明、粘稠流体状，具有蜂蜜自身独特的香味。蜂蜜的营养成分较为复杂，主要成分是糖类物质，包括单糖、二糖和低聚糖，还含有多酚类化合物、酶类、维生素、蛋白质、氨基酸以及矿物质等[2]。蜂蜜为天然食品，具有抗菌、消炎、润肺止咳、润肠通便、增强心肌功能、降低胆固醇、保肝、促进组织再生和创面愈合等药用功效[3-5]。因其天然和独特的功效，蜂蜜越来越为广大消费者所青睐，需求日益攀升。

蜂蜜应密封保存，与空气隔绝，避免阳光照射，放置在阴凉、干燥、通风的室内，不可与其他有异味的物品同放。若蜂蜜在储存过程中保存不当，吸收空气中的水分，容易滋生微生物，引起蜂蜜发酵变质，变质后形成多种物质，包括乙醇、二氧化碳和甘油等，在液体表面产生许多气泡，对蜂蜜的品质和风味均造成不利的影响，降低蜂蜜的食用价值，亦影响消费者的身体健康。因此，迫切需要建立一种快速有效测定甘油含量的检测方法，从而可参考甘油含量的高低来判断蜂蜜的变质程度。目前，测定蜂蜜中甘油含量的检测方法有：GB/T 18932.6—2002紫外分光光度法[6]、GH/T 1106—2015气相色谱-质谱联用法[7]、高效液相色谱法[8-9]。使用GB/T 18932.6—2002需采购酶制剂试剂盒，价格昂贵，检测成本高，不利于推广；GH/T 1106—2015样品需要经过衍生化，对颜色较深的蜂蜜产生干扰，影响甘油含量的准确测定[10]；GH/T 1313—2020高效液相色谱法[8]操作步骤繁琐，对检测人员的操作经验和仪器的精度要求较高，市场上难以购置到阴性蜂蜜，制备阴性蜂蜜费时费力。

本文采用混合试剂溶解直接测定蜂蜜中甘油的含量，操作步骤简单、快速，有效降低企业的检测成本，满足蜂蜜企业的质量控制需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：由上海冠生园蜂制品有限公司提供。

试剂：丙三醇(甘油，纯度>99%，阿法埃莎(中国)化学有限公司)；甲醇(色谱纯，DIKMA)；乙腈(色谱纯，DIKMA)；实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(Agilent LC1260，配1260RID检测器，安捷伦科技有限公司)，分析天平(MS204TS，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，涡旋振荡器(VORTEX 3，艾卡(广州)仪器设备有限公司)，超声波清洗器(KQ-100型，昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1标准曲线的配制

甘油标准贮备溶液：准确称取2 g甘油于10 mL容量瓶中，用水稀释、摇匀，浓度为 200 mg/mL。4 ℃密封保存3个月。

甘油工作标准溶液：取适量甘油贮备标准溶液，以与样品相同的溶剂逐级稀释得到10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L和250 mg/L的标准工作溶液。

1.3.2色谱条件

色谱柱：ZORBAX Carbohydrate analysis 4.6×250 mm 5-Micro；流动相：80%乙腈+20%水(v/v)；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：40 μL；示差折光检测器检测室温度：35 ℃。

色谱柱：XBrige® BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column；流动相：85%乙腈+15%水(v/v)，其他条件如上所示。

1.3.3样品前处理

称取蜂蜜样品5 g(精确至0.000 1 g)至25 mL容量瓶中，加乙腈/甲醇/水混合溶液(3/1/2，v/v)溶解并定容，涡旋振荡2 min，过0.45 μm有机相滤膜后进高效液相色谱仪分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

分别使用ZORBAX Carbohydrate(柱1)和XBrige® BEH Amide(柱2)色谱柱，以乙腈水为流动相，蜂蜜样品直接溶解进高效液相色谱仪分析。如图1所示，使用柱2检测的色谱图中目标峰后面出现鬼峰，果糖和葡萄糖的色谱峰向右倾斜，可能是因为该色谱柱不适用于含糖量较高的样品直接测定分析，需净化除糖。而使用柱1的各个色谱峰峰形对称，分离较好，故选择ZORBAX Carbohydrate色谱柱作为后续研究使用。

柱1： ZORBAX Carbohydrate； 柱2： XBrige® BEH Amide

2.2 流动相的选择

本文考察了流动相中乙腈/水的体积比分别为75∶25、 80∶20、 85∶15 时对甘油分离的影响。如图2所示，随着乙腈比例的增大，甘油出峰时间越晚。乙腈/水比例为85∶15时，目标峰出峰时间为8.3 min，色谱峰峰高下降，峰宽变宽，仪器分析时间较长。乙腈含量较低即比例为75∶25时，目标峰产生拖尾，两个糖峰和溶剂峰的峰形也较差，80∶20时甘油出峰时间为6.9 min，与杂峰分离，各个色谱峰峰形都对称，分析时间短。以80∶20乙腈水为流动相。

图2 不同流动相检测甘油的色谱图

2.3 提取溶剂的选择

蜂蜜的含糖量一般大于70%，主要为果糖和葡萄糖，果糖、葡萄糖和甘油的性质相近，较难分离，使用硅胶固相萃取小柱和氧化铝小柱分离后仍有30%以上蜂蜜糖分残留，所以选择合适的溶剂直接溶解。为研究溶剂对蜂蜜中甘油溶解性的影响，分析了表1中几种溶剂的提取效果，由表1所示，相同称样量时溶剂中有机溶剂的含量与检测灵敏度呈正相关，并且有机溶剂中乙腈含量越高灵敏度越高。当乙腈/水溶液中添加超过一定阈值的单糖或二糖后，就会出现明显的相分离现象，溶剂体系6和体系10中果糖和葡萄糖的含量超过阈值产生两相分离，分析结果不准确，故称取5 g样品时选择乙腈/甲醇/水(3+1+2)为提取试剂。当样品中甘油含量较高时，可适当降低称样量，增加提取溶剂中乙腈的比例，峰形更佳，称取2 g样品时选择乙腈/甲醇/水(4+1+1)为提取试剂。

表1 溶解对提取效果的影响

2.4 线性范围和定量限

采用外标法测定蜂蜜中的甘油含量，以甘油的浓度为横坐标(x)，与该浓度相对应的峰面积为纵坐标(y)，建立标准曲线，线性回归方程为y=316.010 752x+164.796 8，甘油浓度在10 mg/L～250 mg/L浓度范围内相关系数为0.999 25，线性良好，根据信噪比S/N=10计算，得到定量限为50 mg/kg，满足检测需求。

2.5 加标回收率

称取甘油含量为509 mg/kg的蜂蜜样品，分别添加50 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg的甘油标准溶液，每个水平重复测定3次，结果如表2所示，回收率为94.5%～102.8%，相对偏差为1.05%～2.46%，满足分析要求。

表2 加标回收率和精密度

2.6 实际样品的测定

使用本研究方法(HPLC)和GB/T 18932.6—2002(紫外分光光度法UV)分别检测 3份蜂蜜样品，结果见表3，两种检测方法得出的检测结果比较接近，符合检测方法要求，说明本研究方法准确、可靠。

表3 不同方法测定蜂蜜中甘油含量的检测结果对比

3 结论

本文建立了以混合溶剂法直接测定蜂蜜中甘油含量的测定方法，该方法前处理操作简单快速。通过线性范围、加标回收率、精密度及与其它方法对比等项目的验证，说明此法测定甘油含量的结果准确、可靠，并能有效降低检测成本，可用于蜂蜜生产企业批量快速测定蜂蜜中甘油的含量，参考检测结果来衡量蜂蜜的品质。