MALDI-TOF-MS方法快速鉴定食品中空肠弯曲菌的技术研究

吴福平, 吴瑜凡, 崔思宇, 邵景东

1.张家港检验认证有限公司，张家港 215600； 2.张家港海关综合技术中心，张家港 215600； 3.华东理工大学分析测试中心,上海 200237； 4.常州经济开发区环境卫生管理处,常州 213000

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)是革兰氏阴性菌，菌体弯曲小逗点状，微需氧，是目前主要食源性病原菌之一，可引起人及动物多种疾病，主要症状为腹泻性肠炎，被认为是细菌性腹泻的主要原因[1-3]。

目前，空肠弯曲菌鉴定方面主要依据GB/T 4789.9—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》的传统生化来进行，检测时间较长，且对于深加工食品中由于细菌受到损伤从而导致检测难度加大。随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR、16S rRNA基因测序技术、多重PCR法及变形高效液相色谱等方法也越来越多的应用于空肠弯曲菌的检测，这些方法对于空肠弯曲菌的快速鉴定发挥着重要作用[4-6]。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)是近几年来发展起来的新型快速微生物鉴定技术。其基本原理是，样品与基质在靶表面形成共晶体薄膜，激光照射，基质吸收能量，将能量转移样品解吸，基质和样品之间发生电荷转移，样品电离，经过飞行时间检测器将质荷比(m/z)不同的离子分开，形成特异性肽蛋白质指纹图谱。采集图谱与数据库比对，从而获得鉴定结果。目前MALDI-TOF-MS已应用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌等食源性致病菌的快速鉴定，与传统生化鉴定相比，该技术具备准确、快速、高通量、低成本的检测优势，操作简便，可部分替代传统生化鉴定和分子生物鉴别方法，适用于对病原微生物的快速筛检。但因设备成本高，难以在基层实验室普及，部分微生物数据库还不够完整，随着MALDI-TOF-MS方法的进一步普及和数据库的不断完善，上述不足有望得到有效完善[7-13]。本文通过MALDI-TOF-MS方法对样品前处理的选择、稳定性、特异性等方面进行研究，确定鉴定空肠弯曲菌的可行性。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

1.1.1供试菌株 标准菌株：空肠弯曲菌CampylobacterjejuniNCTC11168，结肠弯曲菌CampylobactercoliATCC33559,结肠弯曲菌CampylobactercoliATCC43478，胎儿弯曲菌CampylobacterfetusDSM 5361，乌普萨拉弯曲菌CampylobacterupsaliensisDSM 5365，红嘴鸥弯曲菌CampylobacterlariATCC 35221，猪肠弯曲菌CampylobacterhyointestinalisATCC 35217。从样品中检测出经其他生化鉴定方法确认为空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的野生分离株共28株，其中空肠弯曲菌25株、结肠弯曲菌3株。

1.1.2培养基与试剂血琼脂平板，购自北京陆桥技术股份有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、BTS标准品，购自德国Bruker公司；VITEK2鉴定卡(NH),购自法国生物梅里埃公司；乙腈，无水乙醇，甲酸，三氟乙酸(TFA)。

1.1.3设备 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Microflex)，德国Bruker公司生产。微生物实验室常规灭菌及培养设备，微需氧培养装置：提供微需氧条件(5% 氧气、10% 二氧化碳和85% 氮气)。

1.2 方法

1.2.1细菌分离与纯化 参照GB 4789.9—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》[14]操作。

1.2.2MALDI-TOF-MS测定

1.2.2.1溶液配制

溶剂I：按照水∶乙腈∶三氟乙酸为50∶47.5∶2.5(v/v)的比例配制，现配现用；BTS标准溶液的配制：用50 μL溶剂I溶解BTS标准品。用移液器反复吹吸溶解BTS粉末，室温放置5 min，再次溶解，待BTS全部溶解后，瞬时离心，用200 μL PCR管进行分装，每管5 μL，-20 ℃保存备用。

CHCA基质溶液的配制：在CHCA粉末中加入溶剂I，使CHCA终浓度为10 mg/mL。振荡混匀，直至溶液澄清。用1.5 mL离心管进行分装，每管50 μL，用封口膜密封管口，室温放置备用。放置后，如出现大量沉淀应弃用。

1.2.2.2样品前处理和点样

采用直接转移法、扩展的直接转移法、甲酸提取法对NCTC 11168空肠弯曲菌标准菌株进行样品前处理，以考察不同处理方法对鉴定结果的影响。直接转移法：单菌落在靶点上涂布成薄层，覆盖1 μL CHCA溶液，自然晾干；扩展的直接转移法：在直接转移法的基础上，中间部分增加覆盖1 μL 70%甲酸溶液并自然晾干；甲酸提取法：取单个菌落加入300 μL去离子水，振荡混匀；加入900 μL无水乙醇，混匀，13 000 r/min离心2 min，弃上清液；再次离心除去上清液，室温干燥3 min；加入30 μL 70%甲酸溶液，吹吸混匀；加入30 μL纯乙腈，吹吸混匀，13 000 r/min离心2 min；取1 μL的上清点样至靶点，自然晾干，覆盖1 μL CHCA溶液并自然晾干。

1.2.2.3数据采集和结果判定 用标准溶液对仪器校准后进行样品数据采集和分析。运用FlexControl软件采集数据，获得样品的质谱图谱；用BioTyper软件将采集的样品图谱与数据库中的标准图谱进行比对，根据匹配度判定结果，分值在2.300～3.000，表示菌种鉴定的可信度较高，可完全确认菌株鉴定结果；2.000～2.299表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定，可基本确认鉴定结果；1.700～1.999表示可能的菌属鉴定，菌株鉴定为不确定结果；0.000～1.699表示鉴定结果不可信。

1.2.2.4特异性试验 选取在生化和形态学与空肠弯曲菌较为相近的近缘株结肠弯曲菌CampylobactercoliATCC33559,结肠弯曲菌CampylobactercoliATCC43478，胎儿弯曲菌CampylobacterfetusDSM 5361，乌普萨拉弯曲菌CampylobacterupsaliensisDSM 5365，红嘴鸥弯曲菌CampylobacterlariATCC 35221，猪肠弯曲菌CampylobacterhyointestinalisATCC 35217，以及分离到的3株结肠弯曲菌疑似菌株进行MALDI-TOF数据采集，并在VITEK结果比对,评价MALDI-TOF-MS鉴定的准确性。

1.2.2.5稳定性试验 通过对比空肠弯曲菌NCTC11168同一传代次数的不同菌落及不同传代次数的鉴定结果，评价MALDI-TOF-MS鉴定的稳定性。

1.2.3VITEK2鉴定 VITEK2 compact全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定。

1.2.4分离菌株鉴定 25株样品分离菌株MALDI-TOF-MS技术鉴定，与VITEK结果相比较。

2 结果

2.1 样品处理方法选择结果三种样品处理方法下空肠弯曲菌NCTC11168的可信度得分均在2.300以上，说明鉴定结果可靠。与其他两种样品处理方法相比，甲酸提取法蛋白指纹图谱的基线平滑、峰强度高(图1)，信噪比高，更适用于后续数据分析。不同的样品处理对MALDI-TOF-MS的鉴定结果有一定影响，选择合适的样品处理方法是保证MALDI-TOF-MS准确鉴定的前提。

图1 三种前处理方法对空肠弯曲菌NCTC11168处理后的MALDI-TOF-MS峰图

2.2 特异性MALDI-TOF-MS检测空肠弯曲菌及其近缘株的结果表明，该方法可以准确区分空肠弯曲菌和其近缘菌株，无假阳性或假阴性结果发生(见表1)。

表1 MALDI-TOF-MS检测空肠弯曲菌及其近缘株的结果

2.3 稳定性由稳定性试验结果(表2)显示，空肠弯曲菌NCTC11168同一传代次数的3个菌落平行样的可信度得分非常接近，且不同传代次数的可信度得分无显著性差异。

表2 MALDI-TOF-MS检测空肠弯曲菌稳定性试验结果

2.4 25株分离菌株鉴定结果结果表明：MALDI-TOF-MS鉴定结果与生化鉴定结果一致，均鉴定为空肠弯曲菌，且MALDI-TOF-MS菌种鉴定的可信度较高(表3)。

表3 25株分离菌株的MALDI-TOF-MS与VITEK鉴定结果

3 讨论

通过比较不同样品处理方法对空肠弯曲菌MALDI-TOF-MS鉴定结果的影响，结果发现甲酸提取法得到的结果蛋白峰数量和高度较另外两种方法更稳定。

本文选取6株与空肠弯曲菌相近且较难区分的近缘弯曲菌属标准菌株进行研究。MALDI-TOF-MS鉴定结果表明，MALDI-TOF-MS能够准确快速的区分弯曲菌近缘菌株，相较于传统生化方法在时效性上均有较大提高。通过与VITEK生化结果比对，两者结果高度一致。

空肠弯曲菌NCTC11168同一传代次数的3个菌落平行样的可信度得分非常接近，且不同传代次数的可信度得分无显著性差异，说明空肠弯曲菌MALDI-TOF-MS鉴定方法的稳定性较好，同一代次及不同代次的鉴定结果具有很好的一致性。

25株样品分离菌株MALDI-TOF-MS鉴定结果与VITEK生化结果一致，均鉴定为空肠弯曲菌，且MALDI-TOF-MS菌种鉴定的可信度较高。说明本研究建立的空肠弯曲菌MALDI-TOF-MS鉴定方法准确度高，可用于空肠弯曲菌快速、准确的鉴定。

综上所述，MALDI-TOF-MS方法具有操作简单、快速、高通量、准确度高等优点，方法可用于食品中空肠弯曲菌的快速筛检，也为其它食源性致病菌快速鉴定方法的建立提供参考，有望发展成为新的检测标准化方法。