一种测量化学发光免疫分析仪用参考光源的设计和研究

邓振进，黄海萍，曹俐，周阳，邬鹏程，高飞，刘向荣，姚健，彭明霞，陈新平

1. 湖南省医疗器械检验检测所，湖南 长沙 410011；2. 湖南乐准智芯生物科技有限公司，湖南 长沙 410205

引言

化学发光是化学反应过程中产生光的现象，这个过程可以被描述为：A+B→[I]*→产物+光[1]，其中，[I]*是反应过程中形成的不稳定的中间物质，处于激发态，由于很不稳定，会释放出多余的能量回迁到稳定的基态，同时多余的能量以光能的形式发射出来[2]。化学发光免疫分析仪是将化学发光和免疫分析结合起来的技术，通过标记的抗原或抗体与待测物进行一系列免疫反应[3]，最后通过测定发光强度得出待测物含量[4]。

化学发光过程释放的能量非常微弱，低于常规光学仪器检测量程，很难对微弱光强度的重复性、稳定性、光源线性等参数进行控制，目前国内化学发光免疫分析仪生产商大部分采用试剂进行生产质量控制，其弊端主要有：① 不同生产商可能选择不同的发光体系，难以做到“标准化”；② 部分发光体系是闪光型发光（如鲁米诺-过氧化氢体系），配制的试剂稳定发光期在30 min以下，不易重复测量[5]；③ 试剂成本昂贵，不利于日常生产的质量控制[6]。为了解决上述弊端，本研究拟研发一款光源，一方面要适应全部发光体系，使标准化成为可能，另一方面要使用方便，造价低廉。

1 方法

设计主要从设计内容、设计指标和设计方案三个方面考虑，而设计内容主要考虑光源结构设计、电路设计、光源调控设计和化学发光免疫分析仪用参考光源四个方面，具体内容，见表1。

表1 考虑设计内容

1.1 光源结构设计

根据化学发光免疫分析仪使用的生物芯片结构和尺寸设计，光源外形与生物芯片尺寸完全相同（根据不同免疫分析仪的结构可定制）。如图1～4所示，参考光源（包括母光源）与生物芯片结构尺寸完全相同，能够较好地在仪器中使用。图1～2示光源结构与生物芯片外形完全一致；图3示光源开关、滤光片插槽位于光源背面；图4示光源充电口位于光源侧面。

图1 生物芯片外形图

图2 参考光源前视图

图4 参考光源三维图

1.2 电路设计

供电使用纽扣电池（尺寸较小，适合参考光源结构小型化）或锂电池（可充电，反复使用）；由于锂电池或纽扣电池在使用过程中电压会逐渐降低，影响光源发光稳定[7]。电路中采用MAX1724芯片稳压，将电池的电压升压至5 V后稳定输出。即使电池电压降低，也能保证电路5 V恒压供电。当电池电压低于0.8 V时，升压模块停止工作，光源熄灭。如图5所示，该电路利用两个NPN型三极管Q2和Q3及电阻R9形成恒流模块，保证能够恒流供电给发光件，进而保证发光件处的稳定光强输出，光子计数稳定性CV<1%，满足化学发光免疫分析仪使用要求。

图5 母光源供电电路

1.3 光源调控设计

图6未增加干涉滤光片或中性密度滤光片的光源为母光源，增加干涉滤光片或中性密度滤光片后构成参考光源。干涉滤光片可控制光谱输出，中性密度滤光片可控制输出光强[8]。

光源使用LED，单色或白色。单色LED可不使用干涉滤光片，根据所需光谱选择合适的单色LED[9]。白色LED可配合干涉滤光片使用，干涉滤光片能有效地控制光源输出光谱（干涉滤光片规格众多，可根据需要选取）。

选择合适透过率的中性密度滤光片插入母光源中，可有效控制光源的输出光强，构成参考光源。中性密度滤光片透过率可准确计量，滤光片透过率与光源相对强度呈正比，透过率可表述为光源相对光强，从而实现溯源[10]，可选滤光片型号和透过率，见表2。

表2 滤光片型号和透过率

扩散凝胶作为光扩散剂，能有效地将光散射，实现光源的均匀输出[11]。该部分可以模拟试剂各方向均匀发光特点，提高光源与试剂发光的相似性。

外壳内还设计有位于发光件与第一中性滤光片之间光路上的反射片。发光件发出的光通过反射片反射后再经过第一中性滤光片，可以避免将发光件、第一中性滤光片、光输出窗口设置在同一直线上，从而避免形成长直光路，缩小外壳在单一方向上的尺寸。

1.4 化学发光免疫分析仪用参考光源

如图6所示，将合适透过率（τ=0.01%）的中性密度滤光片插入母光源中即构成参考光源，将光源强度衰减到仪器线性范围下限，测量化学发光免疫分析仪的重复性、稳定性[12]；从表2中选择5个中性密度滤光片，插入母光源中构成参考光源，光源强度覆盖3个数量级，共构成5个参考光源，测量化学发光免疫分析仪的线性[13]。

2 结果

2.1 检测装置及示意图

具有单光子探测器的测试装置本身提供暗室或在光暗室内测量来排除环境干扰。单光子探测器光谱响应范围需要覆盖光源光谱范围，同时单光子探测器需要在其线性范围内工作[14]。如滨松H10682-110单光子探测器，测试距离：单光子探测器距离光源35 mm[15]，见图7。

图7 检测装置及示意图

2.2 重复性测试

选用接近线性范围下限的参考光源进行测试，连续测试10次，将所得数据按公式(1)～(2)计算变异系数（Coefficient of Variation，CV，%）[16-19]，重复性测试结果，见表3。

表3 重复性测试结果

其中，s是标准差，是10次测量结果的算术平均值，Xi是每次实测结果，n是实测的次数，CV是变异系数。

2.3 稳定性测试

选用接近线性范围下限的参考光源进行测试，连续测试10次，两次测试之间的间隔时间至少为3 min，记录测光值，用公式(3)计算相对极差[16-19]，稳定性测试结果，见表4。

表4 稳定性测试结果

其中，Xmax是10次测量结果的最大值，Xmin是10次测量结果的最小值，是10次测量结果的平均值。

2.4 光源线性测试

至少使用5个强度的参考光源，参考光源发光强度覆盖3个数量级，每个光源重复测量3次，并记录参考光源的测量结果。计算各光源3次测量结果的平均值（yi）。以每个光源的标定功率或标定的功率相对值（xi）即透过率为自变量，以实际测试得到的发光值（yi）为因变量求出线性回归方程，按照公式(4)计算线性回归的相关系数r[16-19]。

其中，r是相关系数，xi是各个样品的标定功率或标定的功率相对值，yi是各个样品测定结果的均值，是标定功率或标定的功率相对值的均值是光源测定总结果的均值。

表5 光源线性测试结果

3 讨论

目前国内化学发光免疫分析仪生产商大部分采用试剂进行生产质量控制，试剂难以做到“标准化”：配制的试剂稳定发光期在30 min以下，不易重复测量[6]且试剂成本昂贵。本研究根据化学发光免疫分析仪的原理和技术特性[16-19]，设计参考光源，发光件为普通的LED灯，本设计能够实现皮瓦量级甚至更低光强级别的稳定光输出；通过更换干涉滤光片可以实现任意中心波长的光谱输出，从而模拟不同的化学发光试剂；通过更换第二中性滤光片可以实现线性光输出；可用于化学发光免疫分析仪的校准或进行稳定性测试、重复性测试、线性测试；结构简单，适用性好，成本低，测量结果准确可靠[20]，可在脱离试剂的情况下对仪器进行测试，满足仪器注册检测、性能评价的需求。参考光源的设计具有重大的科学意义和实用价值，批量生产中能提高出厂检验的效率，能够对行业标准进行补充和完善，推动化学发光免疫分析行业发展。