lncRNA DLX6-AS1靶向miR-195-5p调控前列腺癌细胞增殖、侵袭

刘俊玲 肖艳景 娄欣 白慧丽 张全武

(郑州大学附属郑州中心医院病理科，河南 郑州 450000)

非编码RNA在各种人类疾病中的关键作用，其可分为短链非编码RNA(<200个核苷酸)和长链非编码RNA(lncRNAs；>200 核苷酸)〔1〕。 lncRNA参与各种生理和病理过程，包括增殖、分化、侵袭或染色体失活〔2，3〕。lncRNA DLX6-AS1在正常的脑组织中过度表达，在肺腺癌中观察到高DLX6-AS1表达并且与组织学分化和TNM分期相关〔4，5〕。 DLX6-AS1在肝细胞癌组织中也有上调，并与临床预后相关〔6，7〕。 然而，DLX6-AS1如何调节前列腺癌发生及其与前列腺癌发展相关的分子机制仍然未知。本研究旨在探讨lncRNA DLX6-AS1靶向miR-195-5p调控前列腺癌细胞增殖侵袭。

1 材料与方法

1.1材料 前列腺癌细胞PC3、正常前列腺上皮细胞RWPE-1购自美国ATCC；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-基丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学(ECL)发光液和放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；基质胶、Transwell小室购自美国BD。

1.2方法

1.2.1细胞的培养 将前列腺癌细胞PC3、正常前列腺上皮细胞RWPE-1用含10% FBS的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化约1 min，按照1∶3的比例更换培养基，每2 d传代1次。

1.2.2细胞的转染 调整PC3细胞至105个/ml，将si-NC、si-DLX6-AS1、miR-NC、miR-195-5p、si-DLX6-AS1+anti-miR-NC、si-DLX6-AS1+anti-miR-195-5p按照脂质体LipofectamineTM2000试剂盒说明书要求将以上核酸序列按照1∶2的比例添加至PC3细胞，转染48 h，用qRT-聚合酶链反应(PCR)检测转染效率，转染成功后分别标记为si-NC组、si-DLX6-AS1组、miR-NC组、miR-195-5p组、si-DLX6-AS1+anti-miR-NC组、si-DLX6-AS1+anti-miR-195-5p组，用于后续试验。

1.2.3qRT-PCR检测细胞中DLX6-AS1、miR-195-5p的表达 按RNA抽提试剂盒说明书要求提取RNA，进行定量，然后按逆转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行DLX6-AS1、miR-195-5p的检测。以U6 为内参，用2-△△Ct计算DLX6-AS1、miR-195-5p的表达。U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；DLX6-AS1：上游引物5′-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3′，下游引物5′-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3′；GAPDH上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；miR-195-5p上游引物5′-GCGTAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，下游引物5′-CTGTCGTCGTAGAGCCAGGGAA-3′。

1.2.4MTT比色法检测细胞的增殖 将1.2.2各组细胞制成混悬液，调整密度至104个/ml，然后接种至96孔板，取适量1.2.2各组细胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，终止培养，弃去培养液上清，然后每孔加150 μl DMSO，振荡使结晶充分融解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的增殖能力与细胞的吸光度呈正比。

1.2.5Transwell法检测细胞的迁移和侵袭 调整细胞密度至106/孔接种细胞6孔板，培养至融合度达到75%，更换为对应的无血清培养基培养过夜。取100 μl加入上室内，600 μl含血清的培养基加入下室内，细胞常规培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤2次。显微镜下(400倍)观察小室下表面附着的迁移细胞，随机取3个视野拍照计数，取平均数。将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测 按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作。psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性为内参，psiCHECK2-DLX6-AS1 WT和psiCHECK2-DLX6-AS1 MUT的表达为对照，转染24 h后，检测荧光强度。海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值即反应DLX6-AS1与miR-195-5p的结合力。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1DLX6-AS1和miR-195-5p在前列腺癌细胞PC3和前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达 与RWPE-1组相比，PC3组细胞中 DLX6-AS1表达显著升高，miR-195-5p表达显著降低(P<0.001)。见表1。

表1 DLX6-AS1和miR-195-5p在前列腺癌PC3细胞和前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达

2.2抑制DLX6-AS1表达对前列腺癌PC3细胞增殖的影响 与si-NC组相比，si-DLX6-AS1组细胞中DLX6-AS1表达量显著降低，48、72 h时，细胞活性显著降低(均P<0.01，P<0.001)。见表2。

2.3抑制DLX6-AS1表达对前列腺癌PC3细胞迁移、侵袭的影响 与si-NC组相比，si-DLX6-AS1组PC3细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低(P<0.001)。见表2，图1。

图1 前列腺癌PC3细胞的迁移、侵袭(结晶紫染色，×400)

2.4miR-195-5p过表达对前列腺癌PC3细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-195-5p组细胞中miR-195-5p表达显著升高(P<0.05)，48、72 h时，细胞活性显著降低(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)。见图2、表3。

图2 miR-195-5p过表达对前列腺癌PC3细胞迁移侵袭的影响(结晶紫染色，×400)

2.5DLX6-AS1靶向调控miR-195-5p 生物信息学预测结果见图3，DLX6-AS1的3′UTR端具有7个与miR-195-5p的5′UTR端互补的核苷酸序列，UGCUGCU。与miR-NC组相比，miR-195-5p组WT-DLX6-AS1细胞的荧光活性显著降低(P<0.05)，MUT-DLX6-AS1细胞的荧光活性变化不显著(P>0.05)。见表4。与si-NC组细胞中miR-195-5p表达水平(0.33±0.03)相比，si-DLX6-AS1组(1.02±0.08)显著升高，与pcDNA组(0.35±0.04)相比，pcDNA-DLX6-AS1组(0.12±0.03)显著降低(P<0.05)。

图3 DLX6-AS1的序列中含有与miR-195-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-195-5p表达逆转了抑制DLX6-AS1表达对PC3细胞增殖、迁移侵袭的作用 与si-DLX6-AS1+anti-miR-NC组相比，si-DLX6-AS1+anti-miR-496组细胞中miR-195-5p表达显著降低，48、72 h时，细胞活性显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高(均P<0.001)。见表5、图4。

1～2：si-DLX6-AS1+anti-miR-NC组、si-DLX6-AS1+anti-miR-195-5p组图4 抑制miR-195-5p表达逆转了抑制DLX6-AS1表达对前列腺癌PC3细胞迁移侵袭的作用(结晶紫染色，×400)

3 讨 论

大量研究发现lncRNAs作为竞争性内源RNA起作用以调节miRNA的表达水平，因此在癌症的发展中起关键作用。An等〔8〕在胰腺癌的研究中发现，DLX6-AS1的高表达与较大的肿瘤大小、晚期TNM分期和淋巴结转移呈正相关，敲除DLX6-AS1明显抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，另外，miR-181b是DLX6-AS1的下游靶标，敲除miR-181b可逆转DLX6-AS1敲低引起的细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用，此外，DLX6-AS1敲低还可抑制体内肿瘤生长和肿瘤转移，揭示了DLX6-AS1通过减弱miR-181b在胰腺癌中的内源功能来促进癌细胞增殖和侵袭。Zeng等〔9〕研究发现，在肾细胞癌肿瘤组织中鉴定出与正常肾组织相比上调的lncRNA DLX6-AS1，DLX6-AS1通过靶向miR-26a促进肾细胞癌细胞生长和肿瘤发生，Li等〔10〕在肝癌的研究中，首次证明DLX6-AS1在癌组织和细胞系中与正常邻近和细胞系相比明显上调，本研究结果表明，通过靶向miR-424-5p，上调的DLX6-AS1促进肝癌的细胞增殖、迁移和侵袭。

miRNA与肿瘤生长、转移、血管发生和药物抗性有关。Tao等〔11〕研究发现，在前列腺癌患者中高水平的miR-195和miR-16与无复发生存率呈正相关，且miR-195和miR-16与PD-L1、PD-1呈负相关。Ma等〔12〕研究发现，异常的miR-195表达与前列腺癌的预后不良及存活率低相关，miR-195的较低表达出现在多西紫杉醇(DOC)抗性前列腺癌细胞中(DU145/DOC)，而非DOC敏感的前列腺癌细胞。miR-195提高了抗性前列腺癌细胞的敏感性DOC抑制CLU，提示miR-195可能是一种潜在的有希望的抗药性分子靶标前列腺癌。