超高效液相色谱-质谱法同时测定水产品中硝基呋喃类代谢物、孔雀石绿及氯霉素残留量的方法验证

◎ 母昌立，王 蓓，迟志娟，王 姣，周益政，王淳纯，刘培培

（1.江苏省太仓市农产品质量监督检验测试中心，江苏 太仓 215412；2.北京六角体科技发展有限公司，北京 101102）

在《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》（中华人民共和国农业农村部公告 第250号）中明令禁止孔雀石绿、硝基呋喃类、氯霉素等3类6种药物在水产养殖中使用，在动物性食品中不得检出。为此，国家相关部门出台了相应的检测标准[1-3]。除了国家标准检测方法之外，针对3类6种药物的残留检测，国内外文献也相继报道了酶联免疫吸附法[4]、色谱法[5]、质谱法[6-9]。

综合上述检测标准及文献报道，没有3类6种药物同时前处理进行检测的报道，因此，本文验证了北京六角体科技发展有限公司生产的水产品中孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物、氯霉素前处理试剂盒在本实验室的适用性。此次验证包括产品适用范围、标准曲线、线性相关系数、检测灵敏度、检测精密度及方法回收率。

1 材料与方法

1.1 材料

本方法以鲫鱼、河虾和河蟹为试验材料，验证该产品是否满足本实验室的要求。

1.2 试剂与耗材

水产品中孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物、氯霉素前处理试剂盒（包含检测试剂A、检测试剂B和固相萃取柱），北京六角体科技发展有限公司；呋喃唑酮代谢物（AOZ）、阜南他酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（AHD）和呋喃妥因代谢物（SEM）混合标准溶液、氯霉素（CAP）标准溶液、孔雀石绿（MG）和隐色孔雀石绿（LMG）混合标准溶液、氯霉素-D5标准溶液、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-13C15N2混合标准溶液、孔雀石绿-D5和隐色孔雀石绿-D5混合标准溶液、氯霉素-D5标准溶液，以上标准溶液浓度均为100 mg·L-1，天津阿尔塔科技有限公司；乙酸铵（色谱纯）、甲醇（色谱纯、乙腈（色谱纯、正己烷（色谱纯）和甲酸（色谱纯），美国Fisher公司；GHP微孔滤器（0.22 μm），美国Waters公司；鱼肉粉中孔雀石绿（含隐色孔雀石绿）质控样，大连中食国实检测技术有限公司。

1.3 仪器与设备

5500型高效液相色谱-串联质谱仪：美国AB公司；3-18K高速离心机：德国Sigma公司；涡旋振荡器：德国IKA公司；恒温水浴锅（DK-600）：上海冉绘实业有限公司。

1.4 前处理方法

取绞碎的试料4.0 g置离心管中，加100 ng·mL-1的氯霉素 -D5标准工作液，AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-(1，2-15N2，13C)混合标准工作液和孔雀石绿-D5和隐色孔雀石绿-D6混合标准工作液各100 μL，再加4.0 mL检测试剂A，1.0 mL衍生化试剂，充分混匀后，65 ℃超声提取20 min，其间摇匀2～3次。超声后加入2.5 mL检测试剂B，振荡混匀，加入一管提取剂1、5.0 mL提取剂2，振荡10 min，8 000 r·min-1离心5 min。

用5.0 mL提取剂2活化固相萃取柱，取3.0 mL上清液过活化后的固相萃取柱，并挤干柱体，用离心管接流出液，备用。用2.0 mL乙腈+0.5 mmol·L-1乙酸铵缓冲溶液（75+25，v/v）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，涡旋混匀后备用。

硝基呋喃类代谢物、氯霉素待测液：取1.0 mL洗脱液添加到流出液中，50 ℃下氮气吹干，用1.0 mL水复溶，再用1.0 mL正己烷去除油脂，下层即为硝基呋喃类代谢物和氯霉素的待测液，经0.22 μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱法测定。

孔雀石绿待测液：剩余洗脱液即为孔雀石绿待测液，经0.22 μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱法测定。

1.5 检测方法

1.5.1 硝基呋喃类代谢物检测方法

硝基呋喃类代谢物的检测参照母昌立等[9]的方法。

1.5.2 氯霉素检测方法

色谱柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流动相：水（A）+甲醇（B）=60+40；流速：0.5 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：40 ℃；离子源：电喷雾ESI，负离子；扫描方式：多反应监测MRM；气帘气：206.84 kPa（30.0 psi）；雾化气：344.73 kPa（50.0 psi）；辅助气：344.73 kPa（50.0 psi）；离子源温度：550 ℃。监测离子对及对应质谱参数见表1。

1.5.3 孔雀石绿检测方法

色谱柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流动相：乙腈 +5 mmol·L-1乙酸铵 =75+25；0.5 mL·min-1；进样量：1 μL；柱温：40 ℃；离子源：电喷雾ESI，正离子；扫描方式：多反应监测MRM；气帘气：206.84 kPa（30.0 psi）；雾化气：344.73 kPa（50.0 psi）；辅助气：344.73 kPa（50.0 psi）；离子源温度：550 ℃。监测离子对及对应质谱参数见表1。

表1 氯霉素、孔雀石绿及其同位素标记物的主要质谱参数表

1.6 标准曲线的制作

1.6.1 硝基呋喃类代谢物标准曲线制作

精密量取适量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合标准工作液，置于不同离心管中。按1.4处理，制得0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列浓度，利用1.5.1方法进行测定，每个浓度测定2次。

1.6.2 氯霉素和孔雀石绿标准曲线制作

分别精密量取适量的100 ng·mL-1的氯霉素和孔雀石绿标准工作液于10 mL容量瓶中，加入100 ng·mL-1的对应同位素内标标准工作液250 μL，用流动相定容，制得 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列浓度，利用1.5.2和1.5.3进行测定，每个浓度测定2次。

1.7 灵敏度的验证

在对应标准中，硝基呋喃类代谢物在动物源食品中的检测限为 0.25 ng·g-1，定量限为 0.50 ng·g-1[1]，氯霉素在动物源食品中的检测限为0.1 ng·g-1，定量限为0.2 ng·g-1[3]，孔雀石绿和隐色孔雀石绿动物源食品中的检测限为0.5 ng·g-1[2]。在每种样品中加入适量的目标化合物标准溶液，使各化合物在样品中的浓度分别为检测限和定量限，重复10次，按照1.4进行前处理，1.5进行检测。若浓度为检测限时，信噪比≥3，则检测限满足要求；若浓度为定量限时，信噪比≥10，则定量限满足要求[10]。

1.8 精密度的验证

《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》（中华人民共和国农业农村部公告 第250号）规定，硝基呋喃类代谢物、氯霉素和孔雀石绿均为禁用药物，在动物性食品中均不得检出。因此，在添加浓度为检测限、2倍检测限和10倍检测限3个浓度[11]，每种样品每个浓度重复10次，计算相对标准偏差。

1.9 回收率的验证

在每种样品中加入适量的待测物混合标准溶液，使其在样品中的浓度分别为检测限、2倍检测限和10倍检测限浓度，每种样品每个浓度重复10次，按照1.4进行前处理，1.5进行检测。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以目标物的浓度为横坐标，对应浓度目标物峰面积与相应同位素内标峰面积比值为纵坐标，得到各目标物的标准曲线线性方程及相关系数（见表2）。由表2看出，各待测物线性方程的相关系数均大于0.99，相关性良好，可用于准确定量[11]。

表2 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG的线性方程及相关系数表

2.2 灵敏度

在每种样品中加入适量的待测物混合标准溶液，使其在样品中的浓度分别为检测限和定量限浓度，重复10次。经检测发现，当待测物浓度为检测限浓度时，信噪比均＞3；待测物浓度为定量限浓度时，信噪比均＞10。由此可见，本产品的方法检测限和定量限均满足实验室的要求。

2.3 精密度和回收率

每种样品在检测限、2倍检测限和10倍检测限3个浓度进行检测，重复10次，检测后得到表3所示结果。由表3可以看出，6种化合物在鲫鱼、河虾和河蟹中添加回收率均在60%～120%，相对标准偏差＜30%，满足各对应检测标准的要求。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG在鲫鱼、河虾和河蟹的精密度和添加回收率表

2.4 质控样测定

利用1.4的前处理方法处理鱼肉粉中孔雀石绿（含隐色孔雀石绿）质控样，利用1.5.3的检测方法进行检测，检测结果与质控样证书相符。

3 结论

经过验证，北京六角体科技发展有限公司生产的水产品中孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物、氯霉素前处理试剂盒的适用范围、标准曲线、线性相关系数、检测灵敏度、检测精密度及方法回收率均满足要求。本实验室利用此产品对购自大连中食国实检测技术有限公司的鱼肉粉中孔雀石绿（含隐色孔雀石绿）质控样进行测定，检测结果满意。