基于网络药理学分析苦参治疗心律失常的潜在分子机制

韩晓雯，徐惠梅

心律失常(cardiac arrhythmia)是心脏活动的起源和(或)传导障碍导致心脏搏动的频率和(或)节律异常，是临床常见病、多发病。常见于中老年病人，然而，由于现代人生活工作压力大，心律失常发病越来越年轻化，且发病率也在不断升高，医疗消耗巨大。苦参是中医药治疗心律失常的常用药，在临床上常用于治疗气阴两虚以及气滞血瘀型心律失常。本研究旨在以网络药理学为背景，探究苦参治疗心律失常的靶点成分及作用机制，以期为苦参治疗心律失常的机制研究及临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 苦参主要活性成分及靶点预测 通过查询相关文献及检索中药系统药理学数据库(TCMSP)，设置生物口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选依据，获得苦参的主要活性成分，并于TCMSP提取所有活性成分相关的潜在作用靶点，而后于UniProt数据库将相关靶点统一成基因名。

1.2 苦参与心律失常共同靶点筛选 以“cardiac arrhythmia”为关键词，在基因名片数据库(GeneCards)及DurgBank数据库整理心律失常相关的作用靶点基因，利用Draw Venn Diagram对苦参靶点和心律失常靶点基因进行交集映射，获得苦参和心律失常的交集基因。

1.3 药物成分靶点及疾病网络构建与分析 在Excel数据表中整理苦参活性成分靶点的type、network数据表，导入Cytoscape，建立药物活性成分-靶点网络数据图，进行可视化处理。

1.4 药物-疾病蛋白互作网络构建 将苦参与心律失常的共同靶点导入STRING数据库，物种限定为homospain，获得苦参治疗心律失常的核心靶蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)图，并导出string-interaction.tsv文件，以与各个基因相关连节点数目为标准筛选出关键靶点。

1.5 基因本体(GO)富集分析及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析 于基因功能分析网站Metascape(http://metascape.org)导入交集靶点基因，物种设置为homospains，得到苦参治疗心律失常的主要通路及主要作用靶点，结果将以气泡图来展示。

2 结 果

2.1 苦参活性成分筛选结果 以“苦参”为关键词进行文献搜索及TCMSP数据查询，得到苦参的主要作用成分24种，去重后得到相关靶点202个，其中作用靶点数目>20个的活性成分有5个，分别为MOL000098槲皮素，靶点149个；MOL000456菜豆蛋白，靶点23个；MOL003542去甲脱水淫羊藿黄素，靶点28个；MOL000392刺芒柄花素，靶点36个；MOL000006木犀草素，靶点56个。详见表1。以“cardiac arrhythmia”为关键词分别检索GeneCards数据库和DrugBank数据库，共获得978个与心律失常相关的靶点信息，将苦参主要活性成分的作用靶标与cardiac arrhythmia的疾病靶标取交集，共获得交集靶点75个。为苦参的主要成分及相关靶点信息建立network、type文件夹，导入Cytoscape，绘制相互关系网络图。详见图1。

表1 苦参主要成分及其相关靶点数目信息

图1 苦参活性成分靶点图

2.2 心律失常相关靶点 以cardiac arrhythmia为关键词，在GeneCards及DrugBank数据库整合心律失常主要作用靶点共978个。

2.3 苦参-心律失常交集靶点预测 利用在线绘图工具Draw Venn Diagram对苦参靶点及疾病靶点数据集进行交集映射，获得苦参与心律失常的交集靶点75个。

2.4 PPI网络构建 将苦参与心律失常的共同靶点导入STRING数据库，得到蛋白与蛋白相互作用的tsv文件，再将文件导入Cytoscape，并设置以节点(node)大小来反映度值(degree)的大小，以边(edge)的粗细设置来反映关联度的大小，获得最终的PPI网络图。详见图2。由图2可见主要起作用的靶点蛋白有白介细胞素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、蛋白激酶B1(Akt1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、丝裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生长因子(EGF)、胱天蛋白酶3(CASP3)、肿瘤抑制蛋白(TP53)、Jun原癌基因(JUN)等。

图2 交集靶点PPI网络图

2.5 交集基因的富集分析 在Metascape行交集靶点的GO分析、KEGG富集分析。从生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)3种水平对75个交集靶点进行GO分析得到：GO-BP分析到1 806条通路，GO-MF分析到90条通路，GO-CC分析到50条通路，根据P值筛选出GO分析的主要作用通路为血管发育、对无机物的反应、对脂多糖的反应、白细胞分化、活性氧代谢过程等。交集靶点KEGG分析得到174条通路，其中主要包括白细胞介素-17(IL-17)、类风湿关节炎、甲状腺癌、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(AGE)-糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、胰岛素抵抗、白细胞跨内皮迁移、钙信号通路等。再根据P值筛选出前20位，制成气泡图。详见图3～图6。

图3 苦参、心律失常共有基因的GO-BP分析

图4 苦参、心律失常共有基因的GO-MF分析

图5 苦参、心律失常共有基因的GO-CC分析

图6 苦参、心律失常共有基因的KEGG通路富集分析

3 讨 论

心律失常归属于中医学“心悸”“怔忡”范畴。心血管疾病病死率为城乡居民首位，其中心律失常发病率高，而且医疗费用较高，但是临床常用西药治疗本病的作用靶点单一，并有潜在的致心律失常作用，且长期服药肝肾毒副作用较大，西医手术主要是射频消融术，效果明显，但是射频消融手术治疗是损伤性治疗，且费用较高，而中药治疗心律失常作用靶点较多，疗效明显且毒副作用较少，相较西医手术治疗来说，病人接受率更高，但还需要更多的现代药理挖掘来为中医药治疗心律失常提供更多的数据支持和理论依据。

《名医别录》记载：“苦参……养肝胆气，安五脏，定志，益精，利九窍”，表明苦参有宁神定悸的作用。《神农本草经》：“苦参……主心腹气结，癥瘕积聚，黄疸，溺有余沥，逐水，除痈肿。”苦参是常用的心律失常治疗药物，可通过多个靶点来达到治疗目的，本研究通过网络药理学分析为苦参的临床应用提供理论依据。

本研究发现，苦参的主要活性成分有24种，靶点数目>10个的活性成分有13个，其中与心律失常关系较为密切的有效成分主要有芒柄花黄素、木犀草素、苦参碱、槲皮素等，芒柄花黄素能通过减低肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量，对缺氧损伤的H9c2心肌细胞发挥保护作用[1]。木犀草素可上调小鼠肝脏肝X受体α基因(LxRα)表达，并能改善高胆固醇血症和糖耐量异常，可增加HepG2细胞LxRα依赖蛋白的表达，参与胆固醇外流的LxRα、ATP转运盒转运体G1(ABCG1)和B型1类清道夫受体(SRB1)的表达增加，以控制血脂，进而减少对心脏的影响，降低心律失常发生率[2]。苦参碱在体外无β受体阻断作用，但能产生短暂的心动过缓(静脉注射后3～4 min)，降低离体心肌收缩性，阿托品(205)不能阻断该作用[3]。研究表明，苦参碱治疗可以抑制蛋白激酶B(Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活，苦参碱通过抑制小鼠心脏成纤维细胞的增殖、迁移和分化，从而预防肝纤维化重塑和心功能不全的发生，其机制可能是通过上调核糖体蛋白s5(rps5)在体内和体外的表达来抑制p38通路，达到阻断心脏肌细胞纤维化的诱导和进展，从而减少心功能不全，因此，苦参碱可能是治疗病理性心肌纤维化的一种有前途的治疗药物；另外，苦参碱治疗能明显阻拦阿霉素导致的心脏肌细胞凋亡，显著减少人心脏成纤维细胞胶原合成，苦参碱治疗甚至可以逆转实验小鼠先前存在的心脏纤维化；苦参碱已被批准用来医治病毒性肝炎和肝肿瘤，提示苦参碱是有效、安全的抗心肌纤维重塑和心功能不全的成分[4]。槲皮素可以下调高血压大鼠血清中Toll样受体4(TLR4)、核转录因子-κB(NF-κB)p65表达，下调心肌组织中TLR4蛋白及mRNA，以减少血管功能障碍、血管结构改变，达到降低血压、改善心室重构的效果[5]。

苦参与心律失常的交集靶点蛋白有IL-6、VEGFA、EGF、Akt1、MMP9、MAPK1、CASP3、TNF、TP53、JUN等，其中VEGFA、EGF、IL-6与冠心病、心肌肥大等病情进展密切相关，而VEGFA广泛分布于脑、心等组织与细胞之中，在血管形成、动脉粥样硬化等方面有重要的调节作用[6]。VEGFA可有效促进受损血管愈合，创伤中含有的VEGFA的数量与伤口恢复程度、速度呈正相关。表皮生长因子可以加速内皮细胞和成纤维细胞向创伤部位聚集移动，加速创伤恢复。TNF的生物学功能包括抗肿瘤、免疫调节、参与炎症反应等，通过多种途径达到干预治疗心律失常的目的。

GO功能富集分析显示，苦参可通过作用于对受伤的反应、血管发育、对无机物的反应、对细胞迁移的正向调节、对脂多糖的反应等多条信号通路来达到治疗心律失常的目的。根据苦参与心律失常交集基因的KEGG信号通路分析可以了解到，苦参对于心律失常作用与拮抗晚期糖基化终末产物(AGE)诱导的细胞肥大、凋亡、炎症反应相关，另外还可以通过作用于IL-17信号通路、类风湿关节炎、白细胞跨内皮迁移等炎性通道发挥作用，此外还可作用于钙信号通道，调节离子通道，达到改善心律失常的目的[7]。KEGG分析中涉及的类风湿关节炎是一种免疫性疾病，可作用于全身多个器官，除骨关节外，心脏是最常受累的器官，苦参可调节相关信号通道，治疗心律失常。钙离子通道是心律失常的重要离子通道，通过苦参的KEGG作用通路的详细分析可了解到，苦参可对其钙离子调节产生直接作用，达到治疗心律失常的目的。

综上所述，苦参通过调节炎性反应相关通路及免疫调节相关蛋白等治疗心律失常，通过调节相关炎性因子、生长因子等来达到改善心律失常的目的。另外，还可以通过改善血糖、血脂情况来干预心律失常的进展速度。苦参有效成分的作用靶点与心律失常的交集靶点数目多，可以通过作用于多条信号通路来达到治疗心律失常的目的。