复方黄柏液涂剂干预溃疡性直肠炎的网络药理学及分子对接研究

李冬琳，管忠安

溃疡性直肠炎（UP）是一种以腹痛、腹泻或便秘、里急后重，或伴黏液脓血便的非特异性慢性炎症性疾病，腹痛多以左下腹为主，病程呈间歇性发作。近年来我国发病率不断增长[1]。西医多采用口服药物治疗，虽能较快控制病情，但长期使用存在一定副作用且复发率高[2]。近年来中药灌肠治疗结直肠炎因疗效佳、安全性高受到欢迎[3]。复方黄柏液涂剂是由连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣五味清热解毒药物组成的中成药，其中连翘、蒲公英、蜈蚣消肿散结消炎，蜈蚣还可活血走窜；黄柏清热燥湿、泻火解毒；金银花疏散风热、凉血止痢；诸药合用可清热解毒、散痈消肿去腐，用于疮疡溃后伤口感染属阳证者。中医学以“整体观念”和“辩证论证”为指导思想，强调事物的统一和联系性，而网络药理学注重综合、系统和集成性，这正与中医学原则相契合[4]。故本研究运用此方法，通过数据挖掘、筛选整合、计算机模拟、网络构建和分析，预测复方黄柏液涂剂与UP 作用靶点关系，并分析信号通路[5]。使分子生物学与中医药理论相结合，为临床用药提供理论支撑，为实验提供向导，为中医药现代化提供思路。

1 资料与方法

1.1 复方黄柏液涂剂活性化合物筛选 以口服利用度OB ≥30%、肠道上皮渗透性Caco2 ≥0.5、类药性DL ≥0.18 为条件，在TCMSP 筛选出连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣的有效成分[6]。使用Uniprot 数据库将化合物对应靶点转化为Gene Symbol 并排除重复或无效靶点。

1.2 复方黄柏液涂剂成分靶点网络构建 将相关文件导入Cytoscape3.8.2 软件构建药物成分-靶点网络图。

1.3 疾病靶点的获取 以“Ulcerative proctitis”为关键词分别搜索Drugbank、OMIM 和GeneCards数据库查找UP 相关靶点，汇总后通过Uniprot 数据库转化为相应Gene Symbol,排除重复或无效靶点。

1.4 溃疡性直肠炎蛋白互作PPI 网络构建 将UP 疾病有效靶点基因导入String 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）中，导出蛋白互作网络图。

1.5 药物与疾病靶点交互关系分析 将药物和疾病有效靶点Gene Symbol 输入VENNY.2,找出交集靶点并绘制韦恩图。

1.6 复方黄柏液涂剂-UP 共同靶点网络图 通过Cytoscape3.8.2 作出药物-疾病共同靶点图。

1.7 基于DAVID 数据库进行富集分析 将药物与疾病交集靶点导入DAVID6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）,对其进行GO 和KEGG 分析，得到相关数据，并使用微生信（www.bioinformatics.com.cn）作出GO 柱形图和KEGG气泡图。

1.8 关键化合物与核心靶蛋白的分子对接模拟分析 取调控及PPI 网络中排名均靠前靶点作为最佳靶点，在PDB 数据库（（http://www.rcsb.org/）中导出其对应PDB 格式分子结构文件；在TCMSP数据库中导出靶点数量排名靠前化合物的mol2 格式分子结构文件。采用Ledock 软件（http://www.lephar.com/）对上述靶点和化合物进行分子对接模拟，得到最小结合能[7]。

2 结果

2.1 活性化合物及有效靶点筛选 最终筛选出可纳入的活性化合物共 57 个，其中连翘17 个，黄柏25 个，金银花10 个，蒲公英4 个，蜈蚣1 个。通过Uniprot 将靶点转化为Gene Symbol,整理后最终得到111 个有效靶点。

2.2 复方黄柏液涂剂成分靶点网络构建 将药物中57 个成分及111 个靶点构成的调控网络进行可视化，如图1 所示。

图1 复方黄柏液涂剂成分-靶点网络图

2.3 UP 疾病靶点获取 经筛选整理后，最终得到疾病有效靶点68 个。

2.4 UP 蛋白互作PPI 图 将UP 有效靶点导入String，构建UP PPI 图。

2.5 药物靶点与疾病靶点交互关系分析 分析显示，药物111 个有效靶点中有11 个同时为UP 相关靶点，如图3 所示。

图2 溃疡性直肠炎蛋白互作图

图3 复方黄柏液涂剂-溃疡性直肠炎交集靶点韦恩图

2.6 交集靶点调控网络可视化 在Cytoscape 软件将交集靶点调控网络可视化，见图4。

图4 药物-疾病交集靶点调控网络图

2.7 复方黄柏液涂剂对UP 作用靶点GO 功能富集注释分析 GO 分析包括110 个生物过程（BP）、9 个细胞组分（CC）、9 个分子功能（MF）。如图5 所示。

图5 GO 分析柱形图

BP 分析显示，干预过程可能与炎症反应、药物反应、胞外调节蛋白激酶ERK1 和ERK2 联合正调控、序列特异性DNA 结合转录因子活性的正调控、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控等相关；CC 分析显示，可能与胞外区、细胞膜、内质网膜、高尔基体、血小板a 颗粒腔等细胞组分相关；MF分析显示，可能与蛋白质结合、细胞因子及生长因子活性、酶结合、血红素结合、蛋白质同聚活性、前列腺素-内过氧化物合成酶活性等分子功能相关。

2.8 复方黄柏液涂剂对UP 作用靶点KEGG 通路富集分析 KEGG 通路富集共包括38 条，取基因占比前15 名作出可视化气泡图。如图6 所示。

图6 KEGG 通路分析图

KEGG 分析显示，干预过程最可能与类风湿性关节炎、疟疾、炎症性肠病、乙肝通路、核苷酸寡聚化结构域NOD 类似受体信号通路、血管内皮生长因子VEGF 信号通路等相关。

2.9 分子对接结果 取调控网络和PPI 网络中均排名靠前的4 个靶点前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）、过氧化物酶体增生激活受体(PPARG)、血管内皮生长因子受体2（KDR）、重组人白细胞介素6（IL-6）作为最佳靶点，分别与靶点数量排名前11 的关键化合物进行分子对接。对接评分为负值时，表示二者具有作用力，对接评分绝对值＞4.25 时，表示二者具备一定结合活性[8]。由表1 可知，上述4 个靶点与化合物的结合能均为负值且绝对值＞4.25 的超95%，说明复方黄柏液涂剂中有较多组分能与UP 蛋白网络较好结合，即对UP 可多靶点干预。

表1 分子对接结果

3 讨论

复方黄柏液涂剂活性化合物共57 个，可作用于UP 的靶点达111 个。调控网络中，连翘中的汉黄芩素、β-谷甾醇；黄柏中的豆甾醇、蓝堇碱、异紫堇杷明、黄连素、去氢丹参酮ⅡA、原阿片碱、咖维定；金银花中的β-胡萝卜素等为连接节点数较多的核心化合物。而靶点则以KDR、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、PPARG、β2 肾上腺素能受体(ADRB2)、重组人趋化因子(CXCL8)、PTGS1、核受体共激活因子2（NCOA2）、IL6 的连接节点数最多。在PPI 网络中，肿瘤坏死因子TNF、PPARG、KDR、PTGS1、PTGS2、转化生长因子β1（TGFB1）、CXCL8、IL6、4 等具有较多连接节点数，在调控通路中处核心地位。PTGS1、IL6、KDR、PPARG 在二者中均排前位，因此为最佳靶点。从分子对接结果发现11 个关键化合物与上述四个靶蛋白对接结合能均为负数且绝对值较大，可知，药物对UP 的干预效果总体较好。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、调节免疫等作用[9]。其可通过增强超氧化物歧化酶SOD 活性、抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）炎性因子的释放与聚集等途径发挥黏膜保护作用[10]。汉黄芩素为黄酮类化合物，可通过减少促炎细胞因子产生及抑制其与特异性受体结合能力发挥抗炎抗肿瘤作用[11]。豆甾醇可抑制细胞迁移、介导线粒体凋亡，抑制肿瘤发展。β-胡萝卜素具有抗氧化能力，也可减轻炎症反应[12]。PTGS1、PTGS2是一种诱导酶，其上调与肿瘤血管生成有关，在癌细胞中是生产前列腺素E2（PGE2）的关键一步[13-14]。TNF 由活化巨噬细胞产生，可诱发某些肿瘤细胞死亡，参与全身炎症反应。PPARG 可参与炎症反应、凋亡及癌症等过程。血管内皮生长因子A（VEGFA）可特异性作用于内皮细胞并促进细胞迁移、抑制细胞凋亡，其表达与肿瘤发展密切相关[15]。IL4、IL6、CXCL8 均属白细胞介素类，在激活与调节免疫细胞及炎症反应中起重要作用[16]。因此，无论从化合物还是靶点方向考虑，干预过程都与炎症反应、癌症通路密切相关，这与GO 及KEGG分析结果相一致。曾有研究显示，UP 疾病发展的主要因素包含TNF、IL、PTGS2 等[17-18]。相关临床实验证实复方黄柏液涂剂各成分确有消炎抗菌、抗肿瘤、抗疮疡作用[19-20]。这些均与本研究结果相符合。

复方黄柏液涂剂当前研究大多停留在临床观察层面，缺乏分子机制、细胞实验和基因水平相关研究[21-23]。本研究阐明了潜在靶点基因、分子机制，以完善其研究体系，但同时也存在着一定局限性：大量信息的获取依赖于数据库，但其信息完整性及准确性有待商榷；药物在不同个体及同一个体不同代谢过程均有差别，故预测出的靶点难保准确且中药各指标无法量化；停留于计算机模拟而未经实验验证。故网络药理学的进一步发展需依靠数据库的加强完善，同时需结合血清检查、药效药动学从而加强量化分析，且最好进行动物、细胞实验验证[24-25]。

综上所述，复方黄柏液涂剂可通过多通路、多靶点有效干预溃疡性直肠炎，且药效成分与疾病基因分子对接较好。但此结论尚需进一步深入验证。