香叶醇联合冬凌草甲素对MCF-7细胞协同抗癌作用及其机理

刘晓鸣，张媛媛，林晓蓉，高 雄，周伟坚，李 斌,3，陈忠正,3,*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东省科学院微生物研究所，广东 广州 510070；3.广东省功能食品活性物重点实验室，广东 广州 510642）

茶（Camellia sinensis（L.） O.Kuntze）作为普通食品，富含茶多酚、生物碱、维生素、多糖和芳香物质等天然化合物，这些化合物赋予茶叶特殊的风味和生理活性[1]。香叶醇（geraniol，GOH）是茶叶挥发性物质的重要组成成分，具有调节血清胆固醇、神经保护、抗肿瘤、抗炎等多种功效[2-4]。作为食品原料的溪黄草，富含唇形科（Iabtea）香茶菜属（Rabdosia）植物的典型活性物冬凌草甲素（oridonin，ORI），其对多种肿瘤细胞具有生长抑制、诱导调亡和自噬等生物活性作用[5-7]。研究发现，ORI与相关活性物联用具有提升活性物功效的作用。将ORI与香菇多糖联用处理HepG2细胞，发现能起协同抑制细胞增殖的作用，并经由阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡发挥协同抗癌活性[8]，将ORI与马法兰联用也发现具协同抑制骨髓瘤细胞增殖的作用，并发现也是通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡实现抗癌活性[9]。

乳腺癌作为常见的恶性肿瘤，在女性中发病率最高，且呈逐年上升的趋势。流行病学的调查发现，中国及日本等亚洲国家的乳腺癌发病率普遍低于欧美地区，认为与亚洲国家喜食水果蔬菜的饮食结构有关[10]。大量的研究揭示，蔬菜和水果等植物源食品中含丰富的天然化学物质，它们在人体摄入后可通过相加、协同等作用在体内发挥生物活性，对癌症、阿尔茨海默症等慢性疾病的预防起到积极作用[11]。茶叶作为富含生物活性物的世界三大无酒精饮料之一，其挥发性组分中的GOH已被证明具有抑制乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肝癌等多种癌细胞增殖的生物活性[12]，但其与ORI联用是否具有促进抗癌效果的研究鲜见报道。本研究选取人乳腺癌MCF-7细胞系为模型，探讨GOH和ORI联用对癌细胞生长的影响及可能的作用机制。研究的开展有助于增进对饮食中天然活性物间协同增效的认识，并引导优化日常饮食结构促进疾病预防。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌细胞MCF-7 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；ORI（纯度≥98%） 北京普博欣生物科技有限公司；GOH（纯度≥98%） 美国Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS） 美国Gibco公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、细胞周期试剂盒 碧云天生物技术研究所；细胞凋亡试剂盒 美国Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3、Caspase-9分光光度法检测试剂盒 南京凯基生物科技公司。

1.2 仪器与设备

VERSA max酶标仪 美国Molecular Devices公司；HH2型恒温水浴锅 国华电器有限公司；Ckx41显微镜日本Olympus公司；FACSJAZZ流式细胞仪 美国BD公司；Centrifuge 5804R离心机 德国Eppendorf公司；OmegaLumG化学发光仪 美国Aplegen公司；涡旋混合仪 江苏麒麟医用仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

MCF-7细胞培养于37 ℃、5% CO2培养箱中，每隔2 d继代一次。培养液组成为89%（体积分数）1640培养基、10%（体积分数）FBS、1%（体积分数）青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）。

1.3.2 细胞增殖抑制率的测定

取生长状态良好的MCF-7细胞，利用计数板计数调整细胞悬液浓度至2.5×104个/mL，接种于96 孔板，每孔200 μL，5% CO2、37 ℃培养24 h，弃去100 μL旧培养液，分别添加100 μL含ORI（0.625、1.25、2.5、5、7.5、10 μg/mL）或GOH（12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）的无血清培养基（即1640培养基，后同），对照组添加无血清培养基，混匀后继续培养48 h，取出96 孔板，将孔板中培养液弃去，每孔加入10 μL噻唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）溶液（5 mg/mL）37 ℃培养箱中培养2 h后，弃去MTT溶液，每孔加入200 μL二甲基亚砜，置于摇床100 r/min振荡15 min，用酶标仪测定其在550 nm波长处的吸光度A。按式（1）计算细胞增殖抑制率，根据曲线拟合出ORI和GOH单独作用时的半抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

1.3.3 抗癌交互作用及参数计算

参考Chou Tingchao等[13-14]的报道。细胞铺板培养同1.3.2节，根据ORI和GOH单独作用时的IC50值，分别以ORI和GOH质量浓度为0.125 IC50、0.25 IC50、0.50 IC50、1.0 IC50和2 IC50作为联合作用的质量浓度，在对应的质量浓度两两混合或单独添加GOH、ORI，对照组为无血清培养基。按照1.3.2节方法测定细胞增殖抑制率，根据联合作用的效果，计算化合物对肿瘤细胞MCF-7的交互作用参数，即联合作用指数（combination index，CI）和剂量减少指数（dose reduction index，DRI）。CI＞1、CI＝1和CI＜1分别表示药物间具有拮抗、加和及协同作用；DRI表示在相同作用水平下，协同使用时的药物剂量与单独使用的药物剂量比值，药物联合作用的CI及DRI值采用CompuSy软件辅助计算。

1.3.4 MCF-7细胞凋亡率的测定

取生长状态良好的MCF-7细胞，利用计数板计数调整细胞悬液浓度至5×104个/mL，接种于直径60 mm的培养皿中，每皿6 mL，于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养，24 h后弃去旧培养液，根据1.3.3节所得协同抑制MCF-7细胞增殖效果最佳组合，以无血清培养基对照组，分别添加6 mL含GOH（102.81 μg/mL）、ORI（4.32 μg/mL）和GOH（102.81 μg/mL）+ORI（4.32 μg/mL）的新鲜培养基，记为GOH、ORI、GOH+ORI组，继续培养48 h，取出培养皿收集旧培养液，细胞经DPBS洗2 遍，每皿加入2 mL胰酶，消化后，500×g、4 ℃离心5 min，收集细胞，同样条件DPBS洗2 次，离心弃上清后，加入400 μL结合缓冲液重悬，取200 μL于新离心管中作为空白对照，其余的加入5 μL Annexin V试剂，避光反应15 min后，加入10 μL碘化丙啶（propidine iodide，PI）试剂，混匀后于流式细胞仪上检测。

1.3.5 活性氧水平检测

细胞铺皿、样品处理、收集细胞同1.3.4节，用无血清培养基清洗细胞3 次，用无血清培养基稀释2’,7’-二氯二氢荧光素-双乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至终质量浓度为10 μmol/L，将细胞悬浮于稀释后的DCFH-DA中，37 ℃孵育20 min，离心后用无血清培养基洗涤细胞3 次，并加入200 μL DPBS溶液重悬后用流式细胞仪进行检测。

1.3.6 线粒体膜电位检测

细胞铺皿、样品处理、收集细胞同1.3.4节，DPBS清洗后，加入JC-1染色工作液，37 ℃孵育30 min，离心后使用JC-1染色缓冲液清洗2 次，加入200 μL DPBS溶液重悬后用流式细胞仪进行检测。

1.3.7 凋亡蛋白活化程度检测

Caspase-3、Caspase-9蛋白活化程度检测采用分光光度法进行，细胞铺皿、样品处理、收集细胞同1.3.4节，DPBS清洗后，加入含苯甲基磺酰氟（终浓度为1 mmol/L）的裂解液，充分裂解后，14 000×g离心15 min，取上清即为细胞总蛋白，使用Braford法测定各样品的蛋白浓度，按照试剂盒步骤进行测定。

细胞色素c相对表达量的检测采用Western blot方法进行，蛋白收集步骤与上述一致，使用BCA法测定各样品的蛋白质量浓度，将提取得到的蛋白样品与上样缓冲液按4∶1的体积比混合，沸水浴10 min，冷却后取蛋白样品各20 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压80 V电泳30 min，然后电压120 V电泳120 min），电泳结束后将凝胶中的蛋白转印至聚偏氟乙烯膜，用TBST溶液洗膜4 次（每次5 min），将聚偏氟乙烯膜置于封闭液中室温封闭1 h后进行一抗（1∶1 000）孵育（4 ℃过夜）；洗膜后加入TBST溶液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000），室温孵育1 h，洗膜后进行增强型化学发光试剂显影，OmegaLum G化学发光成像系统曝光并拍照记录结果，采用测定蛋白条带灰度值，按式（2）计算蛋白相对表达量。

1.3.8 细胞周期检测

细胞铺板、样品处理、收集细胞同1.3.4节，DPBS清洗后于体积分数70%乙醇溶液中4 ℃固定过夜，500×g离心5 min，4 ℃预冷的DPBS洗涤细胞沉淀2 次，加入PI和RNase A于37 ℃孵育30 min，用流式细胞仪检测。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次，实验结果用平均值±标准偏差表示，采用FlourChem 5500软件进行蛋白条带光密度分析，采用CytExpert软件进行细胞凋亡与线粒体膜电位分析，采用Flowjo软件进行ROS水平、细胞周期分析，采用Oringin 8.0软件作图，计算样品对MCF-7细胞的IC50值，采用Duncan事后检验进行显著性分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 GOH与ORI单独作用对MCF-7细胞增殖的抑制作用

如图1所示，以不同质量浓度GOH、ORI分别处理MCF-7细胞，细胞增殖抑制率随GOH、ORI质量浓度的增加而增加，并呈浓度依赖关系。经计算拟合GOH和ORI作用于MCF-7细胞48 h的IC50值分别为102.81 μg/mL和4.32 μg/mL。结果表明GOH和ORI均能有效抑制MCF-7细胞生长。

图1 GOH与ORI单独作用对MCF-7细胞的影响（n＝3）Fig.1 Effect of GOH and ORI alone on the proliferation of MCF-7 cells(n = 3)

2.2 GOH与ORI联用对MCF-7细胞增殖的抑制作用

根据图1得到的IC50，设计不同质量浓度的GOH和ORI联用处理MCF-7细胞，结果如图2所示，GOH及ORI联用对MCF-7细胞的增殖抑制率呈剂量依赖关系，在其IC50值质量浓度时可抑制86%的细胞增殖，明显高于单独作用时的效果。为评价联合作用效果，根据Chou-Talalay联合用药指数法及运用CompuSy软件计算，得出GOH和ORI在0.125 IC50、0.25 IC50、0.50 IC50、1.0 IC50和2 IC50时的联合作用指数CI（表1），所得CI均小于1，表明GOH和ORI联用具协同作用，且质量浓度在各对应IC50值（GOH IC50＝102.81 μg/mL，ORI IC50＝4.32 μg/mL）时CI值小，且DRI值均大于1，协同抑制细胞增殖效果最佳，后续选择此质量浓度进行机理探究。

图2 GOH与ORI联用对MCF-7细胞的影响（n＝3）Fig.2 Effect of GOH combined with ORI on the proliferation of MCF-7 cells (n = 3)

表1 GOH与ORI联用对MCF-7细胞的抗癌活性（n=3）Table 1 Anticancer activity of GOH combined with ORI on MCF-7 cells (n = 3)

2.3 GOH与ORI联用对MCF-7细胞凋亡的影响

对处理的细胞经Annexin V-FITC/PI双染后，运用流式细胞仪进行检测。由图3可知，对照组仅有（2.80±0.72）%的细胞凋亡率，ORI和GOH单独处理时细胞凋亡率分别为（7.13±1.14）%和（12.82±0.92）%，两者联用时细胞凋亡率显著增加到（79.24±1.38）%。结果表明，GOH联合ORI可诱导细胞凋亡以抑制MCF-7细胞增殖。

图3 GOH及ORI单独及联用对MCF-7细胞凋亡的影响（n＝ 3）Fig.3 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the apoptosis of MCF-7 cells (n = 3)

2.4 GOH与ORI联用对MCF-7细胞内ROS水平的影响

采用DCFH-DA荧光探针结合荧光显微镜和流式细胞仪对细胞进行检测，由图4可知，与对照组相比，GOH和ORI单独处理均能显著增加MCF-7细胞内ROS水平，且后者的作用效果显著高于前者，当GOH和ORI联用处理时，MCF-7细胞内ROS水平显著高于GOH和ORI单独处理组。ORI和GOH单独处理组、联用处理组MCF-7细胞内ROS水平分别提高至对照组的1.42、13.28、27.03 倍，表明GOH和ORI联用可促进MCF-7细胞产生大量ROS，造成氧化损伤并诱导细胞凋亡。

图4 GOH及ORI单独及联用对MCF-7细胞内ROS水平的影响（n＝ 3）Fig.4 Effect of GOH and ORI alone and in combination on intracellular ROS generation in MCF-7 cells (n = 3)

2.5 GOH与ORI联用对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响

采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化，线粒体功能紊乱的标志是线粒体膜电位下降，线粒体功能与细胞色素c的释放息息相关，因此线粒体膜电位变化在线粒体通路的凋亡中起着关键作用。由图5可知，与对照组（5.37%）相比，ORI与GOH单独处理时，绿色荧光细胞百分比分别提高至13.36%和20.75%，均能显著降低线粒体膜电位，当ORI与GOH联合处理时，绿色荧光细胞百分比提高至49.59%，线粒体膜电位下降程度显著高于ORI与GOH单独处理组。说明GOH联合ORI可通过降低MCF-7细胞线粒体膜电位造成线粒体功能紊乱，从而诱导细胞凋亡。

图5 GOH及ORI单独及联合作用对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响（n＝ 3）Fig.5 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells (n = 3)

2.6 GOH与ORI联用对MCF-7细胞内相关凋亡蛋白的影响

为深入探讨GOH和ORI联用对MCF-7细胞凋亡的影响，采用试剂盒分光光度法及Western blot技术分别检测了细胞凋亡启动及执行的Caspase家族蛋白（包括Caspase-3和Caspase-9）活化程度和线粒体通路标志蛋白细胞色素c相对表达量。由图6可知，GOH联合ORI能够上调Caspase-3、Caspase-9活化程度，分别是对照组的1.91、1.79 倍；与对照组相比，ORI单独用药对Caspase-3活化程度无显著影响，但能显著提高Caspase-9的活化程度；GOH单独用药组与对照组相比，Caspase-3和Caspase-9活化程度均得到显著提高。由图7可知，ORI和GOH单独用药及两者联用都能显著促进线粒体细胞色素c的释放，细胞色素c相对表达量分别是对照组的1.71、2.56、3.01 倍。结果表明，GOH联合ORI能促使MCF-7细胞线粒体内膜细胞色素c释放，激活Caspase-3和Caspase-9，从而通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡。

图6 GOH及ORI单独及联用对MCF-7细胞凋亡蛋白的影响（n＝ 3）Fig.6 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the activation of apoptosis-related proteins in MCF-7 cells (n = 3)

图7 GOH及ORI单独及联合作用对MCF-7细胞细胞色素c相对表达量的影响（n＝3）Fig.7 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the expression level of cytochrome c in MCF-7 cells (n = 3)

2.7 GOH与ORI联用对MCF-7细胞周期的影响

细胞周期分布的变化是细胞凋亡的重要评价指标，采用流式细胞仪检测GOH和ORI单独和联合使用对MCF-7细胞周期的变化。由图8可知，ORI和GOH单独及联用后，细胞在S期比例均显著提高至（26.77±3.77）%、（28.42±0.06）%和（38.41±1.61）%，分别为对照的2.02、2.15、2.91 倍。结果表明，GOH和ORI两者联用能够阻止细胞进入G2/M期，细胞大量聚集在S期并发生凋亡。

图8 GOH和ORI单独及联用对MCF-7细胞细胞周期的影响（n＝3）Fig.8 Effect of GOH and/or ORI on the cell cycle of MCF-7 cells (n = 3)

3 讨 论

生物活性物质联用对于其功能发挥具重要意义。生物活性物质联用常表现为大于单独使用效果之和的协同作用，或是等于单独作用效果之和的相加作用，亦或是减弱单独使用效果的拮抗作用[15]。姜黄中的姜黄素与胡椒碱联用表现很好的协同效果[16]，茶叶中的表没食子儿茶素没食子酸酯与紫杉醇联用也表现很好的协同功效[17]。GOH作为除黑茶外的各类茶叶中重要的挥发性物质，在茶叶的品质和功能发挥中扮演重要角色。有研究表明，将GOH和5-氟尿嘧啶联合处理Caco-2和SW620细胞时表现协同作用，联合处理肿瘤小鼠时依然表现很好的协同作用，能使小鼠肿瘤体积减少量由GOH单独作用时的26%上升到53%[18]。本研究设计将GOH与ORI联用探讨对人乳腺癌MCF-7细胞生长的影响，结果表明两者联用具较好的协同效应，能显著抑制MCF-7细胞增殖，推测ORI与GOH联用能增加癌细胞的细胞膜通透性[19]，促进ORI的有效吸收有关。本研究结果在细胞水平证实了茶叶中的挥发性物质GOH与其他食品原料中的活性物所具有的协作效应，为将茶叶与其他食品复配发展茶食品发挥预防保健作用提供重要参考。

近年来抗癌机制的研究往往集中于诱导细胞凋亡、细胞信号转导通路、细胞周期阻滞和细胞自噬等方面[20-22]。其中，细胞周期的调控失调是导致细胞增殖失控的重要原因，因此细胞周期的调控成为癌症控制的关键[23]。有研究表明，GOH可通过诱导人前列腺癌PC-3细胞周期阻滞和细胞凋亡发挥抗癌作用[24]，也可引起人肺癌细胞A549阻滞在G0/G1期，显著抑制A549细胞生长[25]，并对MCF-7细胞呈剂量依赖关系产生了类似的效应[26]。另外，ROS作为细胞代谢过程中由线粒体产生的含氧活性化合物，参与调节细胞内多种分子信号转导通路。高浓度的ROS可氧化细胞成分如脂质、蛋白质和DNA等而破坏细胞完整性，致使细胞产生氧化应激[27]，出现自由基攻击线粒体膜磷脂，致使线粒体膜电位丧失和细胞色素c等膜间蛋白从线粒体中释放[28]。有报道指出，ORI可诱导内源性（或线粒体依赖）和外源性（或死亡受体依赖）凋亡途径，通过激活Caspase-9和Caspase-3诱导SMMC-7721细胞凋亡[29]，或通过激活AMPK通路诱导人肺癌A549细胞凋亡[30]。本研究利用GOH和ORI联合处理MCF-7细胞，发现能将MCF-7细胞增殖阻滞于S期，并检测到细胞内ROS水平、细胞色素c相对表达量、Caspase-9与Caspase-3的活化程度均得到升高，证实ORI与GOH联用具协同抑制MCF-7细胞增殖作用并主要经由激活线粒体凋亡通路和促进细胞周期的阻滞有关。

综上所述，GOH联合ORI能够协同抑制MCF-7细胞生长，并主要通过诱导细胞内产生过量ROS造成氧化损伤，引起线粒体功能紊乱并使细胞色素c从线粒体间隙释放到细胞质中，激活Caspase-9和Caspase-3，诱导细胞凋亡实现抗癌活性。