大豆蛋白水解物苦味评价方法

田霄艳，郑斐庭，冯 涛，喻 晨，宋诗清,*，孙 敏，姚凌云

（1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

大豆蛋白水解物是大豆蛋白经过酶解、微生物发酵后通过分离提取得到的低分子肽类[1]，其氨基酸组成与大豆蛋白完全相同，而且比起大豆蛋白有更加丰富的营养特性和生理功能[2-3]。然而大豆蛋白水解物具有人们所不喜欢的苦味，影响感官品质，从而限制了其应用。

目前关于蛋白水解物的苦味评价方法有感官评价、电子舌评价和动物实验评价等。Lang等[4]在研究咖啡中苦味物质卡奥韦醇时，通过感官评价方法中的半舌实验和强制选择实验评价每种稀释液的苦味，最终得到了卡奥韦醇的阈值。刘瑞新等[5]在研究多类苦味抑制剂对盐酸小檗碱的苦味抑制作用时，基于口尝法和电子舌法建立了ΔI-ρ威布尔规律模型，发现电子舌与感官的评价结果基本一致。Wu Xiao等[6]在研究苦味物质和苦味受体的掩蔽中，通过感官评定考察了高效甜味剂的苦味抑制效果。通过电子舌苦味和甜味传感器响应值进行模型回归分析，提出了苦味预测公式。Zhen Qin等[7]研究发现大鼠的生物电子舌与体质指数相结合的方法能够以高灵敏度检测苦味化合物，这为高灵敏度的苦味检测提供了一种有前途的方法。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波谱常被用来分析物质中的化学组分，而NMR代谢组学分析被认为是感官评估蛋白质水解产物的新工具。它可以获得样品化学成分与感觉属性强度之间的相关性，而不仅仅是某种特性的信号[8]。目前NMR已被用于番茄罐头、鱼蛋白水解液和鸡蛋白水解液等的感官评价研究中[8-9]。

通过文献报道及预实验发现，动物实验因存在实验难度大、成本较高、个体差异大、成功率也低等缺点而较少被应用，感官评价与电子舌分析依然是最常用的方法。本研究通过感官评价及电子舌分析苦味强度，同时对大豆蛋白水解物进行了游离氨基酸组成和含量以及肽分子质量分布进行了分析，为快速准确预测水解物的苦味提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆肽F1（实验室自制样品A）、大豆肽F2（行业标杆A）、大豆肽F3（实验室自制样品B）和大豆肽F4（行业标杆B）、大豆低聚肽粉、玉米低聚肽粉 安琪酵母股份有限公司；氨基酸标准品 日本Wako公司；三氯乙酸、酒石酸、氯化钾、硫酸奎宁 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂 国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

JA2003精密电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；TZ-5000Z电子舌系统 日本Insent公司；GL-21M高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；ICS2500型离子色谱仪、Carbo Pac MA-1阴离子交换柱、CarboPac PA-20阴离子交换分析柱 美国Dionex公司；600高效液相色谱仪 美国Waters公司；Ultimate AQ-C18色谱柱 上海月旭材料科技有限公司；Green ODS-AQ C18色谱柱 上海易创仪器分析有限公司；电热鼓风干燥箱 上一恒科学仪器有限公司；Milli-Q超纯水设备美国Ultra公司。

1.3 方法

1.3.1 感官评价

称取一定量样品，分别按照不同质量浓度（1、3、5 g/100 mL）制备样品溶液。

为了对样品的苦味进行科学的感官评价，参考ISO 8589—2007[10]，感官评价实验在标准感官实验室进行（上海应用技术大学感官实验室）。选取10 名人员组成感官小组（5 名男性和5 名女性，年龄20～30 岁），感官小组共接受6 h的培训（2 周内分别进行3 次2 h的培训）。培训环节如下：1）根据苦味对应的参照物（硫酸奎宁水溶液[11]）来训练感官小组，使小组成员熟悉苦味属性且达成共识；2）感官小组对不同质量浓度参照物感官评定，使其对强度达成共识，以0、2.9×10-3、5.8×10-3、1.2×10-2、2.4×10-2mmol/L硫酸奎宁溶液作为参比溶液，通过5点强度等级从1到5评估苦味强度；“1”表示无，“5”表示最强。

培训结束后，感官小组在感官实验室对样品的苦味进行感官评定，确定苦味强度。感官评价员评价前用蒸馏水漱口，将2～3 mL样品液含在口中10 s，使样品溶液能够充分分散于整个口腔，主要让舌根部感受味道，吐掉后用蒸馏水漱口。每两个样品之间有5～10 min休息间隔，每个小组成员进行3 次平行分析，为减少实验误差，小组成员在3 d内同一时间段进行3 次感官评定。采用10 个成员的平均分数作为该味感强度值，确定不同样品的苦味强度。

1.3.2 电子舌分析

采用TZ-5000Z电子舌系统，该装置配有6 个传感器：AAE（鲜味）、CAO（酸味）、CTO（咸味）、COO（苦味）、AE1（涩味）和GL1（甜味）。为了使实验结果更准确，整个测试过程在25 ℃左右环境温度下进行。实验开始前，先对电子舌进行以下环节调试：活化、初始化和校准等，样品（1、3、5 g/100 mL）用30 mmol/L KCl和0.3 mmol/L酒石酸的基准液配制。实验开始时，将不含样品的基准液倒入小烧杯中放置在电子舌样品1号位，然后将样品倒入小烧杯中，装有样品（包含样品1号位基准液）与清洗液的烧杯交替摆放在电子舌自动进样槽中。所有样品进行3 次电子舌测试，每个样品数据重复采集4 次，采集时间为120 s，通过参差法取3 次误差最小值为每个样本的测量数据[12]，最后将传感器响应值作为样本数据分别进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.3 游离氨基酸含量及肽分子质量分布的测定

游离氨基酸含量及肽分子质量分布的测定参考刘伯业[13]的方法，样品重复测定3 次，每次平行测定3 次。

1.3.4 呈味物质的呈味贡献分析

采用滋味强度值（taste active value，TAV）进行呈味物质呈味贡献的评价[14]，根据TAV可以判断该呈味物质对呈味贡献大小[15]。当TAV大于1时代表该物质有呈味贡献，贡献程度与TAV呈正比；当TAV小于1时，则认为该物质呈味贡献较小。按下式计算TAV。

式中：w1为该物质在样品中含量/（mg/g）；w2为该物质的呈味阈值/（mg/g）。

1.4 数据统计与分析

实验结果用平均值±标准差表示，采用SPSS软件进行单因素方差分析，采用最小显著差法（least significant rang，LSR）进行显著性分析，采用偏最小二乘回归分析（partial least squares regression，PLSR）进行建模预测分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 大豆水解物感官评价结果

味道是食物带给人们的基本感受，是食物对味觉器官化学感应系统刺激后所产生的一种感觉。目前世界各国对于味觉的分类并不一致，但都包含了甜、苦、酸、咸这4 种味感。感官评价是在食品风味研究中常用的方法之一，如Yin Haicheng等[16]通过感官评价来分析枯草芽孢杆菌固态发酵过程中两种胞外酶及豆粕苦味的变化。Kirsten等[17]通过感官评价进行味道稀释分析，在燕麦粉中发现了两种新型呋喃固醇皂苷以及独特的燕麦成分。

本研究将4 个样品分别配制成不同质量浓度（1、3、5 g/100 mL）的样品溶液，10 个感官人员对其进行感官评价，结果如图1所示。相同质量浓度（1、3、5 g/100 mL）下，表示4 个样品苦味强度间显著性的P值分别为0.576、0.354、0.589（P＞0.05），因此相同质量浓度下的不同样品的苦味强度无显著差异。造成此结果的原因一方面可能是样品浓度过高，除苦味外，其他感官属性强度也较高，影响感官评价人员对苦味的评价；另一方面也有可能样品间苦味强度的确无显著性差异。

图1 不同样品感官苦味强度Fig.1 Sensory evaluation of bitterness intensity of different samples

2.2 大豆水解物的电子舌分析结果

电子舌由3 部分组成，分别为味觉传感器阵列、信号采集系统和模式识别系统。味觉传感器阵列是其中最重要的结构单元，相当于生物系统中的舌头，能采集识别不同化学物质的信号信息[18]。Xu Qingbiao等[19]在研究鸡蛋白水解液时，利用电子舌技术筛选出苦味最低的母鸡蛋白水解物组分。Newman等[20]发现电子舌具有作为筛选功能性食品的苦味掩蔽成分工具的潜力，可用于确定合适的甜味剂来掩盖苦味。由于4 个样品在1、3、5 g/100 mL下感官评价结果无显著差异，因此选取5 g/100 mL质量浓度下的4 个样品进行电子舌分析。

PCA是一种投影方法，与原始变量相比，PCA使用较少数量的主成分来实现数据的降维，可用于模式识别、分类、建模和其他数据评估方面[21]。王聪[22]在研究不同区域柠檬桉叶风味成分时采用PCA，判别结果可以准确显示柠檬桉叶的区域性特征，可用于柠檬桉叶的产地判别。Milosavljevi等[23]在研究不同品种草莓时采用PCA评价草莓中各指标对总抗氧化活性的重要性。

将4 个样品电子舌结果进行PCA，结果如图2所示。在PCA图中两个主成分的累积贡献率为98.8%，说明前两个主成分几乎包含样品全部信息，可以反映样品整体信息。4 个样品间未重叠，说明在味觉属性上样品间存在一定的差异，也说明电子舌可以较好地将不同样品进行区分。

图2 4 个样品电子舌分析PCA图Fig.2 Principal component analysis (PCA) plot of electronic tongue data of four samples

电子舌苦味响应值结果如图3所示。样品间苦味响应值差异显著（P＜0.05），其中F1样品苦味响应值最高，达到9.24；F2样品苦味响应值最低，为6.73。因此，相较于感官评价，电子舌可以更好地从苦味方面区分4 个样品。

图3 5 g/100 mL不同样品电子舌苦味响应值Fig.3 Bitterness response values of electronic tongue for different samples at a concentration of 5 g/100 mL

2.3 大豆水解物的游离氨基酸含量和肽分子质量分布

2.3.1 不同样品中游离氨基酸含量及其TAV

游离氨基酸是非挥发性风味物质中重要的组成部分，具有呈味阈值低、呈味能力强的特点[24]。Yang等[25]研究发现，氨基酸呈味特性可以分为以下其4 种：鲜味、甜味、苦味和无味。4 个样品中游离氨基酸含量如表1所示，将表1中的氨基酸按呈味特性进行如下分类，鲜味氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸；甜味氨基酸：苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸；苦味氨基酸：缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸；无味氨基酸：半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸。

表1 4 个样品中游离氨基酸含量Table 1 Contents of free amino acids in four samples

由表2可知，4 个样品中呈现苦味的游离氨基酸含量远高于其他呈味游离氨基酸。样品F1中苦味氨基酸含量达4 154.33 mg/100 g，分别约是其鲜味氨基酸和甜味氨基酸的8、4 倍，也是4 个样品中含量最高的。样品F3中苦味氨基酸含量次之，F2中含量最少。

表2 4 个样品中游离氨基酸分类及含量Table 2 Free amino acid composition of four samples

采用TAV评价呈味物质呈味贡献[26]。从表3中可以看出，样品中呈鲜味、甜味和苦味的游离氨基酸对味感都有一定的贡献，但呈苦味的游离氨基酸TAV明显大于其他味感游离氨基酸，如F1样品中苦味游离氨基酸TAV总和为59.39，而鲜味游离氨基酸和甜味游离氨基酸分别为13.51和10.79，因此4 个样品具有明显苦味。F1样品中缬氨酸和精氨酸TAV分别为10.85和16.28，是主要呈味贡献游离氨基酸，其TAV远高于其他样品。这与电子舌检测结果相符合，F1样品的苦味最强。

表3 4 个样品中游离氨基酸TAVTable 3 Taste active values of free amino acids in four samples

2.3.2 肽分子质量分布

对于多肽，其分子质量大于6 000 Da时基本无苦味，分子质量较小时，苦味强度与其链长有一定的关联[13]。苦味肽一般具有“结合单元”和“刺激单元”两个功能单元，在苦味受体中苦味肽的直径约为1.5 Å，两个功能单元之间距离为4.1 Å，对于大分子蛋白质和多肽，疏水性氨基酸被包裹在内部，无法与苦味受体相结合，因此无法产生苦味[28-30]。对4 个样品进行肽分子质量分布测定，结果如表4所示。4 个样品中F1样品小于1 000 Da的多肽相对含量最高，为94.17%，这与电子舌苦味响应值相互验证。

表4 4 个样品肽分子质量分布Table 4 Molecular mass distribution of four peptides

2.3.3 游离氨基酸含量、电子舌响应值以及感官评价苦味强度相关性分析结果

PLSR是一种常用的多元统计分析工具，用于快速同时定量预测复杂混合物成分的浓度。PLSR是一种基于因子的多元回归将数据分解为不同主成分，并建立预测校准模型的方法[31]。Bantadjan等[32]在研究鲜木薯根淀粉含量时运用PLSR建模，发现便携式光谱仪预测新鲜木薯根的淀粉含量可行。Steinsholm等[8]在研究鲑鱼和鸡肉中蛋白质水解产物时运用PLSR建模，发现NMR具有对鲑鱼和鸡肉中蛋白质水解产物感官特性进行预测的潜力。

本实验采用PLSR对4 个样品中游离氨基酸含量与电子舌响应值以及感官评价苦味强度进行相关性分析，结果如图4所示。建立的PLSR模型共包括2 个主成分，解释的方差为94%，说明模型可靠性较高。除了F3和F4样品，其他数据都在两个椭圆之间，表明PLSR模型可以很好地解释它们。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸为苦味呈味氨基酸，与电子舌苦味响应值都在模型左侧，其含量与电子舌苦味响应值呈现正相关。4 个样品中只有F1样品与游离氨基酸中蛋氨酸、缬氨酸和亮氨酸都在模型左下角且距离很近，说明这些指标呈显著正相关。感官苦味强度（模型左侧）、游离氨基酸含量（模型右侧）和电子舌苦味响应值（模型右侧）都在两个椭圆之间，说明感官苦味强度与二者呈明显负相关，这进一步验证了上面的猜测，由于样品其他风味强烈和感官评价本身会受到的客观因素影响干扰了苦味评价的准确性。

图4 4 个样品中游离氨基酸含量、电子舌响应值以及感官评价苦味强度的相关性分析结果Fig.4 Correlation analysis of free amino acids contents in four samples with electronic tongue response and sensory evaluation

2.4 苦味值评价方法建立

首先选取4 个样品中最苦的F1样品进行感官评价苦味强度和电子舌苦味响应值相关性研究，探究二者的相关性；在此基础上分别选取不同处理方式及不同质量浓度的大豆蛋白水解物及玉米蛋白水解物进行预测模型的建立及评价。

2.4.1 感官评价结果

将F1样品按0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL的质量浓度进行感官评价，结果如图5所示，苦味强度与质量浓度间相关系数为0.984 2，呈现出良好的正相关性。其中0.25 g/100 mL F1样品苦味强度最高（3.5）；0.05 g/100 mL F1苦味强度最低（1.8）。这一结果说明5 g/100 mL质量浓度下4 个样品间感官评价结果无显著差异的主要原因是样品质量浓度过高。

图5 不同质量浓度F1样品感官评价苦味强度Fig.5 Sensory evaluation of sample F1 at different concentrations

2.4.2 电子舌分析结果

将5 个样品电子舌酸味、苦味、涩味、苦味回味、涩味回味、鲜味、咸味、丰富度响应值结果（苦味回味、涩味回味、丰富度为电子舌系统软件综合响应值得出）进行PCA。如图6所示，在PCA图中两个主成分的累积贡献率为97.0%（＞70%），说明前两个主成分几乎包含样品全部信息，可以反映样品整体信息。5 个质量浓度的样品沿PC1和PC2分散分布，说明5 个样品在呈味上有明显差异。

图6 不同质量浓度F1样品电子舌分析PCA图Fig.6 Principal component analysis (PCA) plot of electronic tongue data of sample F1 at different concentrations

不同质量浓度F1样品电子舌检测苦味响应值结果如图7所示，样品间苦味响应值呈线性关系，其中0.25 g/100 mL质量浓度下样品苦味响应值最高，达到3.51；0.05 g/100 mL样品苦味响应值最低，为1.58。苦味响应值变化趋势和感官评价结果一致。

图7 不同质量浓度F1样品电子舌苦味响应值Fig.7 Bitterness response values of electronic tongue for sample F1 at different concentrations

2.4.3 感官评价与电子舌评价模型建立及验证

通过以上感官评价苦味强度和电子舌苦味响应值趋势图发现，感官评价苦味强度和电子舌苦味响应值均与样品质量浓度呈正相关，因此，为了实现电子舌对感官强度值的快速预测，建立电子舌响应值对感官评价苦味强度的预测模型，并对预测模型的可信度及准确性进行评价。

2.4.3.1 预测模型（定量校正模型）的建立

分别测定不同质量浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL）的F1样品、大豆低聚肽粉的感官评价苦味强度和电子舌响应值（苦味、鲜味、丰富度、咸味响应值），建立感官评价苦味强度的预测模型，在建模过程中，模型所包含的主成分数采用交叉验证的方法确定。校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）和决定系数R2用于检验模型的内部稳健性和拟合效果。模型的预测能力通过验证数据集检验，预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）为其评价参数，以防模型过拟合。

采用PLSR方法建立预测模型时，主成分数与模型的实际预测能力直接相关，因此需要先确定主成分再进行后续模型建立。主成分数过少时，不能充分反映样品被测指标信息，模型拟合不充分，从而降低模型预测的准确度；主成分数过多时，一些包含了噪音的信息会掺入其中进行计算，导致过拟合，从而导致模型的预能力降低，得出错误的预测结论。本实验采用舍一交叉验证法，通过RMSEC和RMSEP两个参数确定主成分数，当RMSEC与RMSEP均较小时即为合适主成分数。通过PLSR建模发现，模型中RMSEC和RMSEP参数都随主成分数增加而降低，因此PLSR预测模型最适主成分数为3。

采用最优的条件，建立感官评价苦味强度预测的最优模型，通过校正集样品对最优模型进行内部交叉验证，结果如图8所示，其回归方程为Y＝0.484X1+0.537X2+0.509X3+0.522X4（式中：Y为感官苦味强度预测值；X1、X2、X3、X4分别为电子舌传感器苦味、鲜味、丰富度、咸味响应值）。

图8 基于电子舌响应值预测感官评价苦味强度模型Fig.8 Predictive correction model for sensory bitterness intensity based on electronic tongue response

结果表明，所建立的基于电子舌响应值预测感官评价苦味强度模型的决定系数（R2）分别为0.93（校正数据集）和0.97（验证数据集），RMSEC分别为0.18（校正数据集）和0.10（验证数据集），说明模型的拟合效果较好，能够通过电子舌预测感官评价苦味强度。

2.4.3.2 模型的预测效果分析

分别测定不同质量浓度（0.07、0.12、0.17、0.22 g/100 mL）大豆低聚肽粉和不同质量浓度（0.05、0.10 g/100 mL）玉米低聚肽粉的感官评价苦味强度和电子舌响应值，利用建立的最优定量预测模型，基于电子舌响应值对6 个样品的感官苦味强度进行预测，预测值与感官评价苦味强度的相关性如图9所示。基于电子舌响应值得到的感官评价苦味强度预测值与实测值吻合良好，6 个样品的感官评价苦味强度预测值与感官评价苦味强度实测值的相关性为0.93，RMSEP为1.00，说明所建立的预测模型预测能力较好。

图9 感官评价苦味强度预测值校正模型的预测结果Fig.9 Prediction of prediction set samples by sensory bitterness intensity correction model based on electronic tongue response

3 结 论

本实验研究了质量浓度5 g/100 mL条件下4 个样品的游离氨基酸含量和肽分子质量分布以从侧面印证4 个样品间苦味值不同的原因。游离氨基酸结果显示F1样品的苦味游离氨基酸含量明显高于其他样品。肽分子质量分布结果显示F1样品小于1000 Da的多肽分子质量高于其他样品。将游离氨基酸与电子舌评价和感官评价之间进行相关性分析，发现F1样品与游离氨基酸中蛋氨酸、缬氨酸和亮氨酸相关性较高，相较于其他样品感官苦味评价相关性也较高，因此选用F1样品进行数学建模。

以电子舌和感官分析技术为基础，利用PLSR建立了电子舌响应值与感官评价苦味强度分析模型，得感官评价苦味强度预测回归方程：Y＝0.484X1+0.537X2+0.509X3+0.522X4。对感官评价苦味强度进行预测，很好地克服了传统感官评价方法的缺点。实验结果也表明本实验所建立的校正模型具有很高的预测能力，预测结果完全可以接受，可以替代常规感官评价分析方法。因此电子舌分析技术可以用于植物蛋白水解物的苦味强度的评价。