茶花鸡FSHR 基因多态性及其与产蛋性能的相关性研究

自先念，柳明正，孙大卫，杜彦丽，何洋，刘永，王坤，豆腾飞，贾俊静，葛长荣

（云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201）

茶花鸡是云南六大名鸡之一，具有抗病力强、肉质鲜美等特点［1］。在养殖过程中，鸡的繁殖、生长性能对鸡场的经济效益有重要影响，因此在生产过程中如何提高鸡的产蛋性能引起越来越多研究者的关注。鸡的产蛋性能通常包括开产日龄、产蛋量、产蛋数和蛋品质等［2］，主要受下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）的调控，由下丘脑和垂体释放的激素可调节卵泡的发育和排卵［3］。产蛋性能受遗传和环境因素影响且遗传力较低，传统育种方法（成本高、时间长）很难对其进行选育，利用有效的分子标记对产蛋性能进行分析，将会加速家禽育种进程，丰富我国地方鸡种的遗传资源库。目前，对茶花鸡的研究主要集中在肉质和生长等方面，对产蛋性能的研究相对较少。促卵泡激素（FSH）属于G 蛋白偶联受体家族，由垂体分泌，是HPG轴中卵泡发育关键的调控因子［4］。研究发现，FSHR能促进卵细胞成熟、抑制卵泡闭锁、诱导芳香化酶活性、刺激颗粒细胞增生、诱导黄体素受体（LHR）的产生及诱发排卵［5］。FSH对类固醇生成、卵泡生长和颗粒细胞的成熟起至关重要作用［6］。FSH与受体（FSHR）结合，通过刺激腺苷酸环化酶和细胞内环磷酸腺苷的产生来介导FSH信号转导［7-8］。然而，到目前为止关于茶花鸡FSHR基因多态性及其产蛋性状的相关性研究仍未见报道，本研究以高低产茶花鸡为研究对象，通过直接测序寻找FSHR基因在茶花鸡群体中的SNPs 位点，并进行基因分型、群体遗传学分析及其与产蛋性状的关联分析，检测该基因在2 个群体各组织中的表达水平，旨在发现有意义的分子标记，为茶花鸡的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鸡

本试验在西双版纳云岭茶花鸡产业发展有限公司的育种场进行，挑选同批次1304 只茶花鸡在相同环境内进行饲养，并按照我国地方鸡饲养标准进行饲喂。鸡群开产后记录每只个体每天产蛋情况及成活率至43 周，经整理后得到试验鸡群18周至43 周每周产蛋数和每周平均蛋重。

1.2 试验方法

1.2.1 样本采集

随机挑选300 只鸡，翅下静脉采血采集茶花鸡血液样本保存于采血管，采血管中加入抗凝剂保存于−20 ℃冰箱，用于DNA 提取。挑选记录期内实验鸡群产蛋总数的前20%组成高产组，后20%组成低产组。分别采集高、低产组下丘脑、垂体和卵巢组织，低温环境下分割切块于冻存管迅速置于液氮中，保存于−80 ℃冰箱，用于RNA 提取。

1.2.2 组织RNA 提取与FSHRmRNA 表达水平检测

按试剂盒操作步骤提取上述组织的RNA，并反转录合成cDNA。利用荧光定量PCR，以β-ac⁃tin 作为内参，利用引物对Fq/Rq 对FSHRmRNA在各组织内的表达水平进行检测。

1.2.3 血液DNA 提取与FSHR基因克隆

按试剂盒操作步骤提取血液的DNA，利用PCR 对FSHR基因进行克隆。经1%琼脂糖电泳检测后，合格的样品送至昆明擎科生物有限公司进行测序。

1.2.4 实时定量PCR（RT⁃qPCR）检测FSHR的表达

基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，总RNA 提取试剂盒（柱式法）、反转录试剂盒以及SYBR® Premix Ex TaPTM II荧光定量试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；根据GenBank 中原鸡（Gallus gallus）的基因序列，使用Primer 5.0 软件设计引物（表1），送至北京擎科（昆明）生物有限公司合成。

表1 荧光定量引物信息Table1 Fluorescence quantitative primers information

1.3 数据统计分析

等位基因和基因型频率，遗传多样性和Har⁃dy-Weinberg 群体遗传平衡计算采用SHEsis 软件进行计算。

采用最小二乘法对基因多态位点和产蛋性状进行分析，首先建立以下模型：

Y表示产蛋性能的测定值，u表示测定群体性状的均值，G表示基因型的固定效应，e表示随机误差，数据的统计分析采用SAS（v9.1）系统进行，数据用“最小二乘均值±标准误”的形式表示。

本试验采用相对定量PCR 检测目的基因与内参基因量，采用SPSS 进行差异显著性检验，通过Excel 处理数据和计算得到基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 FHSR 基因多态性检测

2.1.1 基因组DNA 提取结果

从茶花鸡血液样本中用试剂盒提取基因组DNA 后，紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm 的值在1.70~1.85。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，基因组DNA 无污染和降解，满足PCR扩增要求，可用于后续试验。

2.1.2 PCR 扩增产物和结果

茶花鸡FSHR基因外显子1 的扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，条带清晰无拖尾，所得片段320 bp 与预期片段大小一致，可用于后续测序试验（图1）。茶花鸡FSHR基因的外显子进行测序，利用DNAstar 软件对测序结果与GenBank上提交的鸡FSHR基因原序列进行比对分析。结果在茶花鸡FSHR基因外显子1 上共发现2 个SNPs，分别位于基因组的34 847 bp 和35 000 bp处，命名为：g.34847A→G、g.35000C→T（图2）。

图1 FSHR 基因PCR 产物Fig.1 PCR products of FSHR gene

图2 FSHR 基因突变位点Fig.2 FSHR gene mutation sites

2.2 FHSR 基因群体遗传学分析

2.2.1FHSR基因的群体遗传参数

对茶花鸡FSHR等位基因和基因型进行统计分析和适合性卡方检验（表2），在茶花鸡FSHR基因外显子1 中发现g.34847A→G 和g.35000C→T两个SNPs。其中，g.34847A→G 位点只存在AA和GG 两种基因型，不存在杂合型，AA 基因型频率为0.07，GG 基因型频率0.93，GG 型为优势基因型，G 等位基因为优势等位基因，适合性卡方检验卡方值为55.88，此位点偏离哈温平衡（P<0.01）；g.35000C→T 位点存在CC、TT 和CT 基因型，CC 基因型频率为0.46，TT 基因型频率为0.12，CT 基因型频率为0.42，C 等位基因为优势等位基因，卡方检验结果显示，此位点符合哈温平衡（P>0.05）。

表2 FSHR 基因SNPs 位点基因型及基因频率分布Table2 FSHR gene SNPs locus genotype and gene frequency distribution

2.2.2FHSR基因的遗传多样性度量参数

对茶花鸡FSHR基因外显子1 的2 个SNPs 进行群体遗传学分析（表3），g.34847A→G 位点的有效基因数为1.15，纯合度为0.87，多态信息含量为0.12，属于低度多态；g.35000C→T 位点有效基因数为1.79，纯合度为0.56，多态信息含量为0.34，属于中度多态。

表3 FSHR 基因纯合度、杂合度、有效基因数及多态信息含量Table3 FSHR gene homozygosity，heterozygosity，effective gene number and polymorphism information content

2.3 FHSR 基因与茶花鸡产蛋性能的关联分析

在FSHR基因不同基因型与茶花鸡产蛋性能的相关分析中（表4），g.34847A→G 位点的AA 型个体的开产日龄早于GG 型，开产体重小于GG型，30 周龄产蛋数高于GG 型，但差异均不显著。g.35000C→T 位点的TT 型个体的开产日龄平均值 为167.51，CT 型 平 均 值 为165.43，TT 型 平 均值 为170.26，TT 型 高 于CC 型，显 著 高 于CT 型（P<0.05）；在43 周龄产蛋数上，CT 型个体平均值为89.57，CC 型平均值为85.67，TT 型平均值为84.85，CT 型 显 著 高 于 CC 型 和 TT 型（P<0.05）。

表4 FSHR 基因各SNPs 位点基因型与茶花鸡产蛋性能关联分析Table4 Correlation analysis of genotype of each SNPs site of FSHR gene and egg production performance of Chahua chicken

2.4 组织总RNA 提取结果

采用试剂盒提取茶花鸡高低产组各组织总RNA，利用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm 值，结果在1.85~2.1，经琼脂糖凝胶电泳检测，分别呈现清晰的28S、18S、5S 三条带，亮度和宽度逐渐降低，条带完整无拖尾，表明所提RNA 完整性较好无降解，可用于后续试验（图3）。

图3 茶花鸡组织RNAFig.3 Chahua chicken tissue RNA

2.5 FSHR 基因表达量分析

FSHR基因表达量见图4，相同组织间比较显示：FSHR基因在茶花鸡垂体的表达量高产组高于低产组，在卵巢和下丘脑的表达量高产组显著高于低产组（P<0.05）；不同组织间比较显示：高产组FSHR基因的表达量高低依次为卵巢、下丘脑、垂体，卵巢显著高于下丘脑和垂体（P<0.05），低产组表达量高低依次为卵巢、垂体、下丘脑，卵巢显著高于下丘脑（P<0.05）。

图4 FSHR 基因表达量Fig.4 FSHR gene expression

2.6 FSHR 基因表达量与产蛋性能相关性分析

FSHR基因表达量与茶花鸡产蛋性能相关分析（表5），FSHR基因在卵巢组织中的表达量与茶花鸡30 周龄产蛋数和43 周龄产蛋数极显著相关（P<0.01），相关系数分别为0.81 和0.85；在下丘脑的表达量与30 周龄和43 周龄产蛋数显著相关（P<0.05），相关系数分别为0.61 和0.63；在垂体中的表达量与43 周龄产蛋数显著相关（P<0.05），相关系数为0.42。

表5 FSHR 基因表达量与产蛋性能相关性Table5 Correlation between FSHR gene expression and egg production performance

3 讨论

广泛研究表明，FSHR基因多态性对人和其它动物的生殖性状有遗传影响［9-10］。国外有研究人员发现，FSHR基因启动上的SNP（−29G>A）影响人类雄性激素水平分泌［11］。Zhang 等［12］在巴克夏猪和皖南黑猪的FSHR基因第10 外显子上发现了3 个SNPs（C1491T、G1885A、C1977T）对猪的产子数有显著影响，可用于猪品种的标记辅助选择。Wang 等［13］在小尾寒羊和湖羊上均发现了g.47C>T 位点与产羔数显著相关联。杨孔等［14］在对藏鸡产蛋性能的研究中，发现FSHR基因外显子1 上也发现了1 个SNP 位点，且该位点会对藏鸡产蛋量产生一定的影响。Li 等［15］在对苏肯鸡和东乡鸡的研究中，在启动子区发现了200 bp 的插入缺失位点，突变位点与鸡开产日龄显著相关联；该研究结果与Kang 等［16］的研究结果相同。在本研究中在茶花鸡FSHR基因外显子1 上发现SNP（g.35000C→T）与茶花鸡的开产日龄显著相关联，这与王克华等［17］的研究结果相似，他们在如皋黄鸡上发现2 个SNPs（C+29329A，G+51411A）与开产日龄显著相关联。在茶花鸡群体中，SNPs（g.35000C→T）与43 周龄产蛋数也显著相关，其中CT 型43 周龄产蛋数显著高于CC 型和TT 型。所以FSHR基因SNPs（g.35000C→T）可能对茶花鸡的产蛋有重要影响。另外Li 等［18］在北京油鸡的FSHR基因上发现了5 个与产蛋性能显著相关的SNPs；其 中 位 点g.-181A>T，g.159C>T 和g.-310A>G 与不同周龄产蛋数相关联，位点g.75470A>G 和g.75860G>A 与开产蛋重显著相关联。康丽等［19］研究发现，新杨褐鸡FSHR基因5，调控区的-868 和-237 两个SNPs 显著影响开产日龄和37 周总产蛋数；Li 等［15］在对东乡鸡和苏肯鸡的研究中发现FSHR基因SNP（C1684T）上CC 基因型43 周龄产蛋数高于TC 基因型。此外，Xu 等［20］对 番 鸭 研 究，也 在FSHR基 因 上 检 测 到SNP（C320T）与59 周龄产蛋量显著相关。以上各个研究结果与本研究结果相互佐证，说明FSHR基因可能是影响鸡产蛋性状的潜在遗传标记基因，是控制产蛋性状的基因之一。可为茶花鸡的选育提供一定的理论依据。

FSHR基因虽然被认为是卵母细胞特异的关键因子，但在除卵巢外的其他性腺器官中也有表达，而基因的表达会受遗传和环境等因素的影响，具有性别、组织等特异性［21-23］。陈兰等［24］研究表明FSHR基因在卵巢和睾丸中高表达，极显著高于其他组织且该基因基因在母鸡卵巢和公鸡睾丸组织中均有表达，在公鸡的表达呈先高后低持续下降的趋势。他的研究结果与产舒恒等［25］的研究结果相同。在本研究中FSHR基因在卵巢、下丘脑和垂体中的表达量均是高产组高于低产组，FSHR基因在高低产组卵巢组织中的表达量最高，下丘脑和垂体表达差异不大，这与张响英等［26］的研究结果相似，她们的研究结果表明FSHR基因在狮头鹅的垂体和卵巢组织中均有表达，在卵巢中的表达量显著高于垂体。张宁波等［27］研究比较了FSHR基因在性早熟品种济宁百日鸡和罗曼褐商品蛋鸡卵巢和卵泡中的表达情况，发现这2 个品种在开产前后卵巢和卵泡中FSHR的表达呈显著差异。综上可知，FSHR基因在家禽的生产、繁殖过程中起着重要作用。

4 结论

本研究在茶花鸡FSHR基因第1 外显子上发现2 个SNPs 位点，其中g.35000C→T 位点为中度多态，属于错义突变，显著影响茶花鸡的开产日龄和43 周龄产蛋数。FSHR基因在茶花鸡高产组卵巢中的表达量均显著高于低产组，高低产组卵巢中的表达量均高于下丘脑和垂体，且卵巢中的表达量与30 周龄产蛋数和43 周龄产蛋数极显著相关。