不同矮牵牛品种花香成分差异分析研究

郝瑞杰，张忠强，杨姝婷，张雅静

（山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

矮牵牛（Petunia hybrida）为茄科（Solanaceae）碧冬茄属（Petunia）植物，原产南美温带地区，矮牵牛花色丰富、开花繁茂，是重要的园林绿地栽植花卉［1］。矮牵牛遗传背景明晰，构建再生体系容易，加之较大的花冠和独特的香味，矮牵牛已成为花香、花色研究领域模式植物之一［2］。

花香是花卉的重要观赏性状，随着气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术的深入应用，数百种香花植物的芳香成分已被成功鉴定，研究发现不同香花植物之间芳香成分差异显著，而同一花卉不同品种之间由于亲本差异，其芳香性状也各具特点［3］。现有矮牵牛品种来源于野生原种P.axil⁃laris和P.integrifolia的杂交后代，二者花型及花香都具有明显区别，Verdonk 等研究了矮牵牛‘Mitchell W115’的花香成分，发现其挥发物以苯环类化合物为主，由此在后续研究中逐渐确立了矮牵牛作为苯环类挥发物研究的模式植物地位［4］。

矮牵牛品种繁多，各品种间花香性状差异较大，在当前“康养”概念的助推下，芳香型矮牵牛品种越来越受到人们的青睐，因此系统开展矮牵牛品种花香特征研究意义重大。本研究以8 个系列12 个品种矮牵牛为试验材料，利用嗅觉对其香味浓淡程度进行分类，同时采用HS-SPME 与GCMS 技术，对其盛花期花冠的花香成分进行了检测，并通过主成分分析与聚类分析确定了不同品系矮牵牛花香成分的区别，以期为后续矮牵牛种质评价及香花育种的开展奠定基础，并为矮牵牛香花机制的阐明提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的12 个矮牵牛品种均购自美国泛美种业，分别为‘地毯蓝色’、‘地毯白色’、‘海市蜃楼蓝色’、‘海 市 蜃 楼 白 色’、‘轻 浪 李 纹’、‘轻 浪 红 丝绒’、‘轻 浪 黎 明 玫 红’、‘轻 浪 白 色’、‘二 重 唱 蓝色’、‘旋转玫红’、‘双瀑布蓝色’。挑选长势旺盛且一致的盆栽苗，于测试前12 h 移入实验室以适应环境条件，摘取各品种盛花期花冠进行测定，各品种花冠如图1 所示。

图1 12 个品种矮牵牛盛花期花冠Fig.1 Corolla of 12 P.hybrida varieties in full bloom

试验仪器：Trace 1300 气相色谱仪（Thermo 公司），Trace ISQ 质谱分析仪（Thermo 公司），TDL-4 分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）、萃取头（Supelco，50/30 μm PDMS/DVB/CAR）、固相微萃取样品瓶（江苏杰岛玻璃制品有限公司）。

1.2 试验方法

香型分类：随机选择15 名志愿者对12 个品种矮牵牛花花香进行感官评价，以人体嗅觉器官对其香味浓淡程度进行描述并分类［5］。

SPME 吸附条件：固相微萃取头在气相色谱进样口老化10 min，老化温度270 ℃。摘取盛花期的矮牵牛花冠0.6 g 放置于15 mL 固相微萃取样品瓶中，30 ℃条件下孵化30 min，顶空萃取10 min，自动进样，在进样口解析5 min。

GC（Gas Chromatography）工作条件：色谱柱DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；以He 为载气，流 速1.0 mL·min-1；初 始 温 度40 ℃，保 持2 min，以4 ℃·min-1升温至180 ℃，保持3 min，再以10 ℃·min-1升温至240 ℃，保持2 min。

MS（Mass Spectrometry）工作条件：电离方式为电子电离（Electronic Ionization），传输线温度280 ℃，离子源温度280 ℃，电子能量70 eV，质谱扫描范围45~500 amu。

1.3 统计分析

挥发成分鉴定采用NIST08 谱库检索结合人工解析图谱共同确定，各组分的相对百分含量依据总离子流各色谱峰面积归一法计算。用SPSS20 进行主成分分析，用Origin95、NTSYSpc-2.10e、Canoco5 进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 矮牵牛花冠性状分析

如图2 所示，12 个品种矮牵牛花冠在颜色、冠径、香型等方面均存在较大差异。观察各品种颜色可知，‘地毯蓝色’、‘海市蜃楼蓝色’、‘二重唱蓝色’、‘双瀑布蓝色’均为蓝色，但‘地毯蓝色’颜色相对较浅，‘地毯白色’、‘海市蜃楼白色’、‘轻浪白色’、‘锦浪椰子白’均为白色，且基本无颜色差别。在冠径方面，‘双瀑布蓝色’冠径最大，为5.92 cm，其次为‘旋转玫红’、‘二重唱蓝色’、‘海市蜃楼白色’、‘海市蜃楼蓝色’，均在5 cm 以上。其余品种除‘轻浪白色’、‘锦浪椰子白’以外，冠径均在4~5 cm 之间，无较大差异。‘锦浪椰子白’冠径最小，仅有2.67 cm。根据试验者对花冠香味浓淡程度的描述，按芳香类型将12 个品种分为芳香型、清香型、淡香型3 类，其中‘地毯蓝色’、‘二重唱蓝色’、‘双瀑布蓝色’3 个品种香气最浓，为芳香型；‘地毯白 色’、‘海 市 蜃 楼 蓝 色’、‘轻 浪 李 纹’、‘轻 浪 红 丝绒’、‘轻 浪 黎 明 玫 红’、‘旋 转 玫 红’为 清 香 型；‘海市蜃楼白色’、‘轻浪白色’、‘锦浪椰子白’3 个品种香气最淡，为淡香型。

图2 12 个品种矮牵牛盛花期花冠性状分析Fig.2 Analysis on corolla characters of 12 P.hybrida vari⁃eties in full flowering period

2.2 矮牵牛挥发成分类型

2.2.1 矮牵牛挥发成分种类分析

经GC-MS 检测，在12 个品种矮牵牛花朵挥发物中共检测出66 种成分，其中‘地毯蓝色’与‘地毯白色’挥发成分最多，各含有18 种成分，而‘轻浪红丝绒’挥发成分最少，仅含5 种。由表1 可见花香成分共包括醚类、醇类、酮类、酯类、萜类、烯类、醛类、芳香烃类、脂肪酸类、烷烃类10 大类。‘地毯蓝色’和‘轻浪白色’所含种类最多，均为7 类；‘轻浪李纹’、‘轻浪黎明玫红’、‘旋转玫红’3 个品种包含的种类最少，只有4 类。

不同矮牵牛品种间花香成分种类及数量差异较为明显（表1），烯类物质在12 个品种中均可检测出来，同时也是检测出种类最多的香气成分，在12个品种中共检测到17 种，其中‘轻浪白色’中检测出的烯类化合物最多，达9 种；酯类物质在12 个品种中共检测出15 种，可在11 个品种中检测到，其中含有酯类最丰富的品种是‘轻浪李纹’，达8 种。醇类物质在12 个品种中共检测出12 种，‘海市蜃楼蓝色’中最多，有4 种。酮类、萜类、脂肪酸类化合物在12 个品种中均较少，各类仅检测到1 种。

表1 12 个品种矮牵牛的花香种类Table1 Classification of floral components in 12 P.hybrida varieties

2.2.2 矮牵牛各类挥发成分的相对含量

矮牵牛各类挥发成分的相对含量如表2 所示，醚类、醇类、脂类、萜类、烯类化合物相较于其它种类化合物相对含量较高。在‘海市蜃楼白色’、‘轻浪红丝绒’中，醚类化合物所占比例均高于60%，在‘海市蜃楼蓝色’中也高于30%；在‘海市蜃楼蓝色’、‘二 重 唱 蓝 色’、‘锦 浪 椰 子 白’、‘旋 转 玫 红’4个品种中，醇类化合物所占比例均高于20%，在‘地 毯 蓝 色’、‘地 毯 白 色’、‘轻 浪 李 纹’、‘轻 浪 白色’中有少量醇类化合物；酯类化合物在‘地毯蓝色’、‘地毯白色’、‘轻浪黎明玫红’3 个品种中的相对含量极高，均高于80%，远高于其它9 个品种。萜类、烯类化合物在‘旋转玫红’、‘双瀑布蓝色’2个品种中的相对含量均高于20%。

2.3 矮牵牛关键芳香成分分析

比较12 个矮牵牛品种的主要芳香成分，由表2可见，2-甲基丁酸甲酯、三环萜、β-蒎烯、（S）-（-）-柠檬烯、苯甲酸甲酯分别为各品种主要挥发物。进一步分析其相对含量可知（图3），2-甲基丁酸甲酯在除‘海市蜃楼蓝色’之外的11 个品种中均有挥发，但相对含量却有很大差异，‘轻浪李纹’中2-甲基丁酸甲酯相对含量为90.22%。三环萜是矮牵牛花香中唯一的萜类物质，在‘双瀑布蓝色’中相对含量达56.49%。（S）-（-）-柠檬烯在除‘海市蜃楼蓝色’、‘二重唱蓝色’之外的10 个品种中均有挥发，但在‘海市蜃楼白色’中占比最高，达26.41%。苯甲酸甲酯在‘地毯蓝色’、‘地毯白色’、‘轻浪黎明玫红’、‘锦浪椰子白’4 个品种中特异挥发，其中在‘地毯蓝色’中占比极高，可达97.49%。

表2 12 个品种矮牵牛挥发成分及相对含量Table2 Volatile components and relative contents in 12 P.hybrida varieties

图3 12 个品种矮牵牛花香关键成分占总释放量百分比Fig.3 Percentage of key components accounting for total release amount in 12 P.hybrida varieties

2.4 矮牵牛芳香性状主成分分析

主成分分析可以较为清晰的表明品种与挥发成分之间的联系，并在一定程度上确定挥发物中的致香成分［6］。如图4 所示，苯甲醛、苯甲醇、苯甲酸甲酯等苯环类物质集中于第一象限，对‘地毯蓝色’、‘地毯白色’、‘轻浪黎明玫红’3 个品种有较大的正向影响；第二象限仅有‘海市蜃楼白色’、‘轻浪红丝绒’两个品种，其中（S）-（-）-柠檬烯、正己醚、二甲醚等物质对其有较大的正向影响；第三象限5 个品种分布较为分散，其中三环萜与‘海市蜃楼蓝色’、‘双瀑布蓝色’相关性最大，而乙醇和2-甲基丁酸甲酯则可以较好的解释‘旋转玫红’、‘二重唱蓝色’两个品种，‘轻浪李纹’虽位于第三象限，但靠近原点，与横轴和纵轴的距离都过近，单独的芳香成分不能较好的解释这一品种；位于第四象限的品种有‘轻浪白色’、‘锦浪椰子白’，β-蒎烯、3-甲基己烷、3-甲基戊烷等物质与其的相关性较大，其中β-蒎烯与‘轻浪白色’的分布极为接近，说明其确实是‘轻浪白色’的关键致香物质之一。

图4 12 个品种矮牵牛花香成分PCA 分析Fig.4 PCA analysis of floral components in 12 P.hybrida varieties

2.5 聚类分析

以12 个矮牵牛品种的66 种挥发成分为基础数据建立遗传相似矩阵，分别用数字0 和1 表示某一挥发成分的有无，含有此种挥发成分的数据赋值为1，没有或未检测到该种香气成分的数据赋值为0，以此进行聚类分析［7］。如图5 所示，相似系数0.68 附近第一次分支，矮牵牛12 个品种被分为两类：第一大类包括11 个品种，第二大类仅1 个品种：‘轻浪白色’。在相似系数0.72 附近又将第一大类分为两类：第Ⅰ类包含2 个品种，‘地毯蓝色’、‘地毯白色’，第Ⅱ类为其余9 个品种。在相似系数0.79 附近，又可将第Ⅱ类9 个品种分为3 小类：‘海市 蜃 楼 蓝 色’、‘海 市 蜃 楼 白 色’、‘轻 浪 李 纹’、‘轻浪 红 丝 绒’、‘轻 浪 黎 明 玫 红’、‘二 重 唱 蓝 色’、‘旋转玫红’被聚为1 小类，‘锦浪椰子白’与‘旋转玫红’2 个品种各为1 小类。分析可知同一系列品种间遗传关系基本较为接近，如‘地毯系列’、‘海市蜃楼系列’，但在‘轻浪’系列中，‘轻浪白色’与其余3 个品种却显示出较远的遗传距离。

图5 12 个品种矮牵牛花香成分的聚类Fig.5 Cluster dendrogram of floral components in 12 P.hybrida varieties

续表

续表

3 讨论与结论

花香是观赏植物重要的观赏性状之一，近年来已经成为国内外观赏植物的热门研究领域。根据芳香成分的合成途径，植物花香主要由萜烯类、苯环类及苯丙素类、脂肪酸及其衍生物等组成［8］。本研究利用GC-MS 技术对12个品种的矮牵牛盛花期花冠的挥发成分进行测定，共检测出66 种化合物，分属酯类、萜类等10类挥发物，这与袁媛在9个蕙兰品种花朵中检测到10类挥发物的结果相似［9］，但是矮牵牛各品种之间挥发物类型区别较大，结合各品种花香的嗅觉评价，具有芳香性状的‘地毯蓝色’系列挥发物类型较多，与百合［10］、芍药［11］等的研究一致，芳香型品种都拥有更为丰富的挥发物类型。挥发成分多属于植物次生代谢产物，其生物合成需要通过复杂的代谢通路完成［12］，花朵各类型挥发物往往处于各代谢通路中的不同节点，而酯类物质多属于代谢终端产物［13］，本研究发现芳香型矮牵牛品种能大量挥发酯类物质，且相关品系矮牵牛挥发物类型更为丰富。

植物花朵芳香特征往往由花朵关键挥发成分决定，通过一种或多种芳香成分形成其具有识别性的芳香特征。梅花中乙酸苯甲酯与丁子香酚共同构成了梅花的典型梅香［14］，香茅醇、苯乙醇等共同构成了玫瑰的芳香特征［15］。本研究通过主成分分析确定了各品种的关键芳香成分，但是各关键成分表现出了不同的嗅觉特点，萜烯类物质中三环萜、β-蒎烯、（S）-（-）-柠檬烯在矮牵牛花中占有较高的比重，该类物质在细茎石斛花朵［16］、黄连木叶片［17］中均有挥发，但并没有表现出鲜明的芳香特征。‘地毯’系列主要挥发酯类物质，尤其是苯甲酸甲酯的挥发量占到了全部挥发量的95%以上，主成分分析结果也表示苯甲酸甲酯与‘地毯系列’和‘轻浪黎明玫红’有最高的相关性。苯甲酸甲酯具有强烈的芳香气味，可以用作香水的基础液［18］，且在芳香型矮牵牛中的挥发量极高，因此有理由相信苯甲酸甲酯是本次研究对象芳香型矮牵牛品种的特征芳香成分。

不同矮牵牛品种中花香成分的挥发量均存在较大差异，主成分分析结果表明二甲醚是‘海市蜃楼白色’、‘轻浪红丝绒’的关键成分，聚类分析结果显示二者遗传关系密切。2-甲基丁酸甲酯在所有品种中几乎都有挥发，但其相对含量在‘轻浪李纹’中高达90.22%，而在‘地毯蓝色’中却仅占0.35%，聚类分析结果也显示，二者遗传关系相距较远。矮牵牛野生原种P.axillaris和P.integri⁃folia性状差异较大，P.axillaris具有白色花冠，通过晚上散发苯环类物质吸引天蛾类昆虫授粉，P.integrifolia具有紫色的花冠，香味不明显，一般以蜜蜂授粉。2 个祖先亲本之间的香味差异，使现代矮牵牛在花香性状明显分离［19］，本研究中各品种之间花香差异明显，通过聚类也表现出明显的分群现象。Robert 等［20］研究矮牵牛品种‘Mitchell’发现苯甲酸苯甲酯是其主要挥发成分之一，本研究中同为苯环类物质的苯甲酸甲酯在‘地毯蓝色’中相对含量达97.49%，这说明芳香型矮牵牛更多的遗传了P.axillaris的特征。

花香、花色与花形一直是观赏植物育种关注的重要性状，但是在香石竹中发现，现代香石竹品种由于多注重花形、花色的选择，大多品种失去了香气特征。本研究中所选各品种在花香、花径和花色上也表现出不同规律，虽然花色、花形比较丰富，但是大多数品种香气较淡，这与现代矮牵牛品种缺乏浓郁芳香型品种的现状切合。育种过程中、虽然差异筛选会导致一些不被重点关注的性状退化，但我们在研究中也发现各性状存在一定的相关性，白色矮牵牛品种多为淡香型，其挥发成分种类较少，而蓝色品种香味较浓，挥发成分种类丰富、挥发量大，其关键成分多为苯环类芳香物质。在鸳鸯茉莉研究中也证明花径、花色与花香存在关联，花色变淡的同时，其苯环类特征芳香成分挥发量也逐渐变少［21］。结合本研究结果，在今后的芳香矮牵牛育种工作中，深入阐明性状之间的相关性，更有可能培育出色、香、形俱佳的品种。

矮牵牛不同品种释放的花香成分在类型及相对含量等方面均存在较大差异，这些差异形成了矮牵牛香味特征各异的品种群体，这为矮牵牛的园林应用奠定了坚实的基础。本研究通过GCMS、主成分分析与聚类分析等手段对矮牵牛花挥发物进行了系统分析，其结果不仅能在矮牵牛品种鉴别、康养园艺疗法等方面发挥重要作用，也可以为芳香植物育种工作提供新的思路。