基于特异性PCR的梅花鹿茸和马鹿茸区分

黄家乐，莫惠凤，罗沛豪，马惠仪

香港特别行政区政府卫生署 中医药规管办公室 政府中药检测中心，香港特别行政区

根据《中华人民共和国药典》2020 年版，鹿茸是鹿科梅花鹿和马鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，其混淆品部分来自驯鹿、水鹿、麋鹿等[2-3]。性状鉴别和显微鉴别可快速鉴别鹿茸原药材[4-5]，但对部分缺失性状特征的鹿茸制品存在局限性。DNA 鉴别技术分辨能力强，尤其适用于动物类药材或近缘物种的鉴别。目前的DNA 技术中，特异性聚合酶链式反应（PCR）所涉及的分析仪器少，操作容易且有明确的判定准则，利于检测业界采用和中药业界纳入其质量控制流程，以确保药材货源的正确性和生产中投料的规范性。本研究旨在开发及验证一种基于特异性PCR 技术区分鹿茸正品梅花鹿和马鹿的筛选方法，能有效补充现行鹿茸鉴别法，为相关标准化检测流程的建立及质量控制系统的完善提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Heraeus Megafuge 8R 型离心仪、NanoDrop One型微量核酸浓度测定仪、ProFlex 型PCR 仪（美国Thermo Scientific 公司）；MM400 型球磨仪（德国Retsch 公司）；Thermomixer C 型恒温混合器（德国Eppendorf 公司）；QIAsymphony SP 型全自动样品纯化仪、QIAxcel 型全自动核酸蛋白分析仪（德国Qiagen 公司）；Matrix A 型组织研磨管（美国MPBio公司）。

1.2 试药

蛋白酶K、QIAsymphony DNA Investigator Kit、QIAxcel DNA High Resolution Kits、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、QX DNA Size Marker（德国Qiagen公司）；Platinum™TaqDNA 聚合酶（美国Thermo Sicentific 公司）；自定义引物（比利时Eurogentec 公司和美国Thermo Sicentific 公司）；二硫苏糖醇（DTT，美国Sigma 公司）；GelRed 核酸染剂（美国Biotium公司）。

马鹿茸、梅花鹿茸及鹿茸混淆品共43 份样品，收集自北京、吉林、辽宁、新疆、江苏、海南、山西和香港等地，样品由首都医科大学赵奎君研究员及香港科技大学毕丹和徐红研究员鉴定。香港市面流通的鹿类幼角切片、鹿筋、鹿鞭、鹿肉及食用家畜样品共25 份。其他动物、植物和真菌类样品共5 份，购自中国食品药品检定研究院。4份鱼肉样品来自英国FAPAS®实验室能力测试计划。所有样品都经DNA 测序，利用BLAST 程序与美国国家生物技术信息中心（NCBI）所收载的cytochrome c oxidase subunit 1（CO Ⅰ）、cytochrome b 和16S ribosomal RNA 序列进行比对，确定其来源。样品保存于香港特别行政区政府卫生署政府中药检测中心，见表1。

2 方法与结果

2.1 引物设计

从NCBI 的Nucleotide Database 下载梅花鹿Cervus nipponTemminck、马鹿C.elaphusLinnaeus、水鹿Sambar unicolorKerr、麋鹿Elaphus davidianusMilne-Edwards 和驯鹿Rangifer tarandusLinnaeus 共87 份线粒体基因组DNA 序列（表2），使用MUSCLE[6]进行多重序列比对，分别以梅花鹿或马鹿作为比较对象，在BioEdit[7]上寻找特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，设计引物后导入Primer 3[8]分析其物理特性，修正二聚体或发夹结构，最后合成引物。

表2 鹿类样品线粒体基因组DNA序列

经多重序列比对后，找出梅花鹿和马鹿的特异性位点。梅花鹿线粒体基因组序列DQ985076.1 和马鹿线粒体基因组序列KT290948.1分别定为梅花鹿和马鹿特异性引物设计参照，共设计了8 个梅花鹿（S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29）和1个马鹿（S33）的特异性引物组合，其序列和物理特性见表3。

2.2 样品研磨

按样品采取下述2 种方法研磨：1）称取样品约1 g，剪切成约3 mm×6 mm×6 mm方块后置于不锈钢球磨罐，加入直径15 mm 不锈钢研磨球，用球磨仪在28 Hz 频率下研磨5 min，称取约50 mg 粉磨样品于2 mL 平底离心管。2）若样品体积小，称取样品约50 mg，经剪切后移入Matrix A研磨管中，放入球磨仪，在28 Hz频率下研磨30 min。

2.3 DNA提取

利用QIAsymphony DNA Investigator Kit，在样品、阳性对照和提取阴性对照的管中加入ATL缓冲液960 μL、20 mg·mL-1蛋白酶K 40 μL 和1 mol·L-1DTT 40 μL。漩涡混匀后，放入恒温混合器，56 ℃、2000 r·min-1振荡3 h 或过夜。16 000×g离心15 min，取上清液600 μL加入2 mL平底离心管中，上样到全自动样品纯化仪，按照仪器说明书操作。利用NanoDrop One 型微量核酸浓度测定仪测定样品总基因组DNA 质量浓度，以水调整其终质量浓度至约10 ng·μL-1。

2.4 引物筛选

按以下条件对表3 中的引物进行筛选。反应在200 μL离心管中进行，反应体系包括10×PlatinumTaqPCR缓冲液（不含Mg2+）2.5 μL、50.0 mmol·L-1Mg2+1.0μL、5.0 mmol·L-1dNTPs 1.0 μL、5.0 μmol·L-1正向引物2.0 μL、5.0 μmol·L-1反向引物2.0 μL、PlatinumTaqDNA聚合酶0.25 μL、DNA模板约20 ng，加无菌超纯水至25 μL。PCR 反应参数为95 ℃预变性5 min，循环反应30次（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。结果显示，S22～S24和S29引物对梅花鹿和马鹿样品都产生强度相近的PCR 产物，表明这4 个引物组合不能分辨梅花鹿和马鹿，因此被剔除。S25～S28、S33 的结果中，非目标品种出现比目标品种较弱的DNA条带。

表3 梅花鹿和马鹿PCR引物设计及其物理特性

考察不同的PCR条件对S25～S28、S33的扩增目标条带的改进，包括PCR 缓冲液（Platinum™TaqPCR 缓冲液、Platinum ™TaqDNA Polymerase High Fidelity缓冲液）、Mg2+浓度（1.0～2.0 mmol·L-1）、Taq酶（Platinum™TaqDNA 聚合酶、Platinum™TaqHigh Fidelity 酶）、退火温度（55～68 ℃）和循环次数（25～30 个循环）对扩增目标条带的影响，选择Platinum™TaqPCR 缓冲液、Platinum™TaqDNA 聚合酶、Mg2+最终浓度1.2 mmol·L-1、退火温度63 ℃和循环次数30 为最适宜条件。S27 引物对梅花鹿样品产生单一约223 bp 的条带，而S33 对马鹿样品产生单一约248 bp 的条带，而非目标品种均不会产生任何目标条带，表明S27和S33能分别作为梅花鹿和马鹿的特异性测试引物。因此，最终选择S27和S33引物用于样品DNA扩增。

2.5 PCR扩增

为更能反映引物组合所针对的目标品种，将S27 定名为CNIP-f/CNIP-r，而S33 定名为CELA-f/CELA-r，首4 字母是科学名缩写，f 和r 代表引物方向。CNIP-f/CNIP-r 的目标区域位于DQ985076.1 的第110～332 位碱基，而CELA-f/CELA-r 位 于KT290948.1的第119～366位碱基，均属于12S核糖体RNA。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 的PCR扩增条件见表4。

表4 鹿茸样品的PCR扩增条件

2.6 电泳分析

按需求选择下述电泳方法观察PCR 扩增情况：1）琼脂糖凝胶电泳，体系为1.5%凝胶浓度、0.5%TBE 缓冲液、GelRed 核酸染色、紫外透射仪上观察电泳结果。2）自动化电泳系统，利用QIAxcel DNA High Resolution Kit在QIAxcel Advanced System分析电泳结果。

2.7 方法学验证

2.7.1考察样品DNA 样品DNA 模板需进行UnivP/UnivQ 的PCR 扩增和电泳分析，获得1 条约104 bp的条带才会被采用。

2.7.2重复性 以对应品种的3 份样品A、B 和C进行重复测试，其中A 抽取9份重复样品，B和C各抽取3 份，即合共15 份，按2.5项下条件扩增分析，比较15份重复样品的PCR 扩增情况。所有重复样品都应出现对应品种的特异性条带。结果表明，15 个梅花鹿茸重复样品在CNIP-f/CNIP-r 的PCR 反应中，均产出梅花鹿特异性条带。15 个马鹿茸重复样品，在CELA-f/CELA-r 的PCR 反应亦扩增了马鹿特异性条带，说明方法重复性良好。

2.7.3重现性 共进行3 次测试，每次测试的操作人员、仪器及测试日期的组合不相同。3 次测试都采用同一份的对应品种的样品，每次抽取3 份重复样本，按2.5项下条件扩增分析，比较3次测试中共9 份重复样品的PCR 扩增情况。所有重复样品都应出现特异性条带。结果表明，在不同的操作人员、时间、仪器的组合下，对CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 各进行3 次测试，9 个梅花鹿茸重复样品均得到梅花鹿特异性条带，9 个马鹿茸重复样品获得马鹿特异性条带。

2.7.4检测限 以对应品种的1 份样品抽取8 份重复样品，按2.3项下方法进行DNA 提取，用水将DNA 模板质量浓度调至10 ng·μL-1。再以水进行10倍序列稀释，得到10.0、1.0、0.1 ng·μL-1和10、1 pg·μL-1共5 个质量浓度，按2.5项下条件扩增分析，找出最低可被扩增的DNA 模板质量浓度。结果表明，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 检测限均为10 ng·μL-1，而其余质量浓度均不能检出。

2.7.5专属性 利用鹿科动物样品作测试，包括目标品种和非目标品种，所采用的鹿类样品包括19 份梅花鹿茸、20份马鹿茸、2份水鹿的幼角和2份麋鹿角，每份样本抽取2份重复样品进行测试，按2.5项下条件扩增分析，CNIP-f/CNIP-r 的测试结果表明，19 份梅花鹿茸样品都检出梅花鹿特异性条带，而其他样品没有可观察的DNA 条带。CELA-f/CELA-r 测试中的20 份马鹿茸样品都获得马鹿特异性条带，其余样品皆为阴性。

2.7.6假阳性 利用非鹿科动物、食用家畜、植物和真菌样品作测试，包括水牛、黄牛、绵羊、猪、鸡、大头鳕、无须鳕、绿青鳕、大西洋鳕、刺五加、马鞭草、葛和灵芝。每份样品抽取2 份重复样品进行测试。CNIP-f/CNIP-r 的测试结果表明，梅花鹿茸样品检出梅花鹿特异性条带，而其他样品没有可察的DNA 条带。CELA-f/CELA-r 测试中的马鹿茸样品都获得马鹿特异性条带，其余样品皆为阴性。

2.7.7可行性 在香港市场收集鹿茸及其他鹿类产品21 份，包括9 份马鹿茸切片、5 份驯鹿幼角切片、1份白唇鹿角切片、4份马鹿筋、1份马鹿鞭和1份梅花鹿肉干，每份样本抽取2 份重复样品进行测试，按照按2.5项下条件扩增分析，考察方法的适用性。结果表明，CNIP-f/CNIP-r 测试中梅花鹿肉干样品出现梅花鹿特异性条带，而CELA-f/CELA-r 能筛选出马鹿茸切片、马鹿筋和马鹿鞭，与DNA 测序的结论一致。

2.7.8实验室间比对 委托独立实验所进行实验室间比对工作，共同验证测试方法，确保实验操作的规范性和结果的一致性。各实验室对同一样本的共同验证特异性PCR 结果应一致。实验室间比对结果表明，参与比对的实验室所得的结果相同，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 能区分梅花鹿和马鹿。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 引物对梅花鹿、马鹿和其他混淆品的电泳结果见图1～6。

图1 梅花鹿的CNIP-f/CNIP-r电泳图

图2 马鹿的CNIP-f/CNIP-r电泳图

图3 其他鹿科动物的CNIP-f/CNIP-r电泳图

图4 梅花鹿的CELA-f/CELA-r电泳图

图5 马鹿的CELA-f/CELA-r电泳图

图6 其他鹿科动物的CELA-f/CELA-r电泳图

2.8 混合样品研究

对混合来源的鹿样品进行研究。配制3 组等质量混合样品，包括梅花鹿和马鹿混合样品、梅花鹿和驯鹿混合样品、马鹿和驯鹿混合样品。提取模板DNA后，利用CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r进行测试。结果显示，CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r均能检出目标品种，且不受其他鹿品种影响（图7～8）。

图7 混合样品的CNIP-f/CNIP-r电泳图

图8 混合样品的CELA-f/CELA-r电泳图

3 讨论

目前已发表的鹿茸DNA 鉴别方法有特异性PCR[9-12]、PCR 限制性内切酶片段[13]、实时荧光定量PCR[14]、多重PCR[15]、熔解曲线分析[16]、随机扩增DNA[17]、DNA 条形码[18-20]等，都证明DNA 技术能有效鉴别鹿茸。相对上述研究，本实验所建立的筛选方法有4 个特点：1）能筛选源自梅花鹿和马鹿的鹿茸饮片和鹿制品。基于梅花鹿和马鹿同为鹿茸的来源品种[1]，有2 种可行的设计方案。第一种方案是同时检验出梅花鹿和马鹿，优点是操作较简单。第二种方案是分别针对梅花鹿和马鹿进行检测，优点是可明确区分梅花鹿和马鹿。考虑到梅花鹿茸的市价明显高于马鹿茸，所以本筛选方法取第二种方案。2）已通过了一系列的方法学验证测试，实验室间比对结果亦表明方法可靠。3）设有动物类DNA 模板的质量控制。UnivP/UnivQ 的目标区域是线粒体16S rRNA 上的保守位置，对动物类基因组具有广谱性，加上PCR 产物长度只有104 bp，符合作为质量控制的先决条件，确定可从样本中提取出的动物源DNA，其PCR 扩增情况能作为筛选结果的佐证。4）CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r采用相同的PCR 试剂配方和反应条件，可减省工序。本筛选方法已上载到香港特别行政区政府卫生署的网站供参考（https://www.cmro.gov.hk/html/gb/GCMTI/gcmti_dnamethod.html）。

建立方法时，引物设计应遵循3 条准则：1）限制PCR 扩增物于200～350 bp，有助于提升PCR 成功率。因中药材的基因组DNA 大多已被降解，理论上越短的PCR产物越容易被扩增。2）将特异性SNP位点置于引物3′的最末端。在PCR 的延伸过程中，未能互补的3′端会影响5′至3′聚合酶活性，令引物具有区分目标物种和非目标物种的能力。3）若目标品种在引物3′端的第三和第四个碱基位置出现种内变异，将该位置转为简并碱基，避免因碱基不互补而降低PCR 产物，减损检测灵敏度。根据下载的梅花鹿和马鹿的线粒体基因组序列排序结果，发现两者的种内的变异大，稳定的特异性SNP 位点不多，局限了引物设计，按上述3 条准则，最终只能设计出1 个马鹿引物组合，并需为3′末端的第三和第四个碱基转为简并碱基。检测限测试中，DNA 质量浓度梯度设定为0.001～10 ng·μL-1，测试结果显示最低质量浓度为10 ng·μL-1，即检测上限，较合适的设定应为50.0、20.0、10.0、1.0、0.1 ng·μL-1。

为获得可靠的结果，使用本筛选方法时应注意：1）加入阳性对照和提取阴性对照；2）在PCR 反应中加入PCR阴性对照；3）以UnivP/UnivQ的PCR扩增作为质量控制；4）确保DNA 模板量达到方法要求。关于第四点，在方法学验证的可行性测试中，已表明本方法不仅能筛选鹿茸，亦适用于鹿筋、鹿肉干和鹿鞭，本方法的检测限为10 ng·μL-1，操作人员应评估某些部位，如毛发的DNA 模板量能否满足相关要求。若样品不符合最低要求，或需要进一步确定本方法的筛选结果，可按检测目的采用其他鉴别方法作为互补，如鉴别动物类药材的DNA 条形码检测法。

已有文献证实，DNA 技术能应用于混合来源药材。贾静等[21]对市售鹿茸粉进行DNA 条形码检测，发现当中3 份样本的COⅠ测序峰图杂合度较高，重新测序前利用分子克隆方法得到单一来源序列，以解决因存在多于1 种COⅠ序列而令测序峰图杂乱，导致无法作出判断的问题，结果表明，该3 份样本均含多于1 种的鹿品种或类群。本课题组尝试利用本方法对混合来源的鹿样品进行筛选，初步发现CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 均能检出目标品种，且不受其他鹿品种影响。但本方法的适用范围是筛选单一来源的鹿类样品，是否同样适用于混合来源样品需进行方法学验证测试。