基于Heracles NEO超快速气相色谱电子鼻对温郁金醋制前后气味差异标志物的快速识别研究

秦宇雯，费程浩#，苏联麟，季 德，李 昱，张 伟,2，姜梁钰，毛春芹,3*，陆兔林,3*

基于Heracles NEO超快速气相色谱电子鼻对温郁金醋制前后气味差异标志物的快速识别研究

秦宇雯1，费程浩1#，苏联麟1，季 德1，李 昱1，张 伟1,2，姜梁钰1，毛春芹1,3*，陆兔林1,3*

1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012 3.江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心，江苏 南京 210023

基于Heracles NEO超快速气相色谱电子鼻对温郁金醋制前后气味差异标志物进行快速识别研究，拟建立一种基于气味的有效快速识别方法。通过建立生、醋温郁金的Heracles NEO检测方法，结合Arochembase数据库，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA）和变量投影重要性指标（variable importance in projection，VIP）方法，对其色谱峰进行数据处理和分析。经Heracles NEO检测，温郁金共18个色谱峰，利用Arochembase数据库表征出17个气味成分，采用PCA、DFA均能将生、醋温郁金准确区分，通过OPLS-DA模型中VIP值分析，在MXT-5和MXT-1701色谱柱下，5、6、10号色谱峰的VIP均＞1.0，推测γ-松油烯、芳樟醇、乙酸癸酯是生、醋温郁金的潜在气味差异标志物。Heracles NEO可应用于生、醋温郁金的气味差异标志物快速识别，具有重要的应用价值。

温郁金；醋制；Heracles NEO；气味差异标志物；快速识别；γ-松油烯；芳樟醇；乙酸癸酯

温郁金Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎具有行气破血、消积止痛功效，被誉为“气中血药”[1-2]。其临床常见的饮片有生品和醋制品[3]。生品药性峻猛，长于行气止痛，多用于食积胃痛、瘀积腹痛等；醋制品入肝经血分，可缓其药性，更善破血化瘀，常用于瘀滞经闭、胁下癥瘕痞块等气滞血瘀证[4-6]。《中国药典》2020年版一部明确要求使用醋制品的中成药制剂共16种，约占其中成药制剂总数的39%[1]，其临床功效以活血化瘀为主[3]。因此，其生品和醋制品的准确区分对临床科学合理使用炮制品和提高临床疗效至关重要。

大多数中药中含有挥发性物质，所以特殊气味成为中药性状鉴别的重要特征之一[7]。“辛香”是温郁金非常具有特色的气味，但其生品和醋制品气味上有差异，如《中国药典》2020年版载生品“气微香”，醋制品“微有醋香气”[1]，此描述较为主观和模糊。随着仿生技术的快速发展，电子鼻技术打破了传统经验鉴别的局限，能客观量化气味，体现在各个传感器响应值组成的中药气味指纹图谱的差异上，据此可控制中药材炮制过程的质量，亦可快速准确区分不同炮制方法下的中药，这为气味的客观化、定量化、标准化评价提供了新思路[8-9]。因此，本研究基于Heracles NEO技术结合Arochembase数据库对比分析，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA）、变量投影重要性指标（variable importance in projection，VIP）等多变量统计分析方法对温郁金的干燥根茎醋制前后气味差异标志物进行快速识别，以期为生、醋温郁金的质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

Heracles NEO快速气相色谱电子鼻（配备进样器PAL RSI全自动顶空进样器）、非极性色谱柱MXT-5、中极性色谱柱MXT-1701，法国Alpha MOS公司；GH-380N型高纯氢发生器、GA-380N型低噪音空气泵，北京中兴汇利科技有限公司；FA1104N型电子分析天平，上海菁海仪器有限公司；H-350型高速多功能粉碎机，上海耐塞机械有限公司。

1.2 材料与试剂

10批温郁金采购于浙江省瑞安市通明温郁金专业合作社，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为姜科姜黄属植物温郁金Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，样品来源信息见表1。

表1 样品来源信息

正构烷烃C6～C16混合对照品，美国Restek公司；芳樟醇，批号Y01D7Y17500，质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司；异丙醇，批号1401101，质量分数＞99.7%，上海申博化工有限公司；恒顺镇江香醋，批号20200301，总酸≥55.0 mg/mL，江苏恒顺醋业股份有限公司。

2 方法

2.1 温郁金的炮制

将温郁金的干燥根茎按《中国药典》2020年版一部莪术项下收载生品、醋制品的炮制方法[1]，分别炮制成生温郁金10批（编号W1～W10）、醋温郁金10批（编号WC1～WC10），供实验研究用。

2.2 温郁金供试品的制备

将各批次生、醋温郁金分别粉碎，过五号筛，密封冷藏备用。

2.3 温郁金气味检测方法的建立

2.3.1 孵化温度考察 精密称定W1样品0.2 g，孵化时间20 min，进样体积2000 µL，考察孵化温度45、50、55、60、65、70、75 ℃，每个水平平行3次[10]。最终得出，60 ℃时色谱峰峰形良好，且在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积RSD值最小、最稳定。其中，在60 ℃条件下，MXT-5色谱柱的保留时间RSD值为0.05%、0.03%、0.03%、0.02%、0.05%、0.03%、0.02%，峰面积RSD值为4.70%、1.90%、1.20%、2.24%、2.61%、1.20%、2.02%；MXT-1701色谱柱的保留时间RSD值为0.04%、0.04%、0.04%、0.04%、0.05%、0.06%、0.06%，峰面积RSD值为3.90%、1.09%、2.49%、2.45%、1.72%、2.00%、2.38%。若继续升高温度，则影响其真实气味的分析。因此，选取60 ℃作为最优的孵化温度。

2.3.2 孵化时间考察 精密称定W1样品0.2 g，孵化温度60 ℃，进样体积2000 µL，考察孵化时间5、10、15、20、25 min，每个水平平行3次[10]。最终得出，15 min后色谱峰无明显变化，表明在15 min后其气味已趋于饱和稳定，且在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积RSD值最小、最稳定。其中，在15 min条件下，MXT-5色谱柱的保留时间RSD值为0.21%、0.18%、0.18%、0.22%、0.22%、0.23%、0.19%，峰面积RSD值为1.46%、0.37%、1.30%、2.02%、2.65%、3.14%、3.8%；MXT-1701色谱柱的保留时间RSD值为0.24%、0.20%、0.22%、0.27%、0.29%、0.24%、0.24%，峰面积RSD值为0.9%、0.86%、2.41%、2.46%、3.26%、5.33%、3.96%。因此，选择15 min作为最优的孵化时间。

2.3.3 称样量考察 孵化温度60 ℃，孵化时间15 min，进样体积2000 µL，考察称样量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，每个水平平行3次[10]。最终得出，0.3 g后色谱峰无明显变化，且在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积RSD值最小、最稳定。其中，在0.3 g条件下，MXT-5色谱柱的保留时间RSD值为0.11%、0.09%、0.09%、0.07%、0.06%、0.09%、0.11%，峰面积RSD值为3.49%、0.95%、1.68%、1.46%、2.12%、2.27%、3.39%；MXT-1701色谱柱的保留时间RSD值为0.09%、0.07%、0.02%、0.03%、0.02%、0.09%、0.09%，峰面积RSD值为3.43%、1.28%、1.32%、2.27%、2.65%、3.40%、3.54%。因此，选择0.3 g作为最优的称样量。

2.3.4 进样体积考察 精密称定W1样品0.3 g，孵化温度60 ℃，孵化时间15 min，考察进样体积1000、2000、3000、4000、5000 µL，每个水平平行3次[10]。最终得出，2000 µL后色谱峰无明显变化，表明2000 µL时其气味基本趋于饱和稳定，且在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积RSD值最小、最稳定。其中，在2000 µL条件下，MXT-5色谱柱的保留时间RSD值为0.10%、0.11%、0.11%、0.15%、0.15%、0.13%、0.15%，峰面积RSD值为1.28%、1.41%、1.96%、0.41%、0.93%、0.95%、3.04%；MXT-1701色谱柱的保留时间RSD值为0.10%、0.08%、0.08%、0.15%、0.16%、0.16%、0.16%，峰面积RSD值为0.85%、1.66%、1.15%、1.47%、1.34%、0.85%、3.33%。因此，选择2000 µL作为最优的进样体积。

2.4 电子鼻检测参数的确定

通过单因素考察确定生、醋温郁金的Heracles NEO检测条件：样品瓶20 mL；孵化温度60 ℃，捕集阱初始温度40 ℃，捕集阱最终温度250 ℃，进样口温度200 ℃，检测器温度260 ℃；孵化时间15 min，孵化炉转速500 r/min，进样体积2000 μL，进样体积流量125 μL/s，进样持续时间21 s，捕集阱分流速率10 mL/min，捕集持续时间26 s，柱温的初始温度40 ℃，柱温程序升温方式4 ℃/s至130 ℃、1 ℃/s至140 ℃、2 ℃/s至175 ℃、0.5℃/s至205 ℃、4 ℃/s至250 ℃，保持60 s；采集时间150 s；称样量0.3 g；FID增益12。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取同一供试品粉末0.3 g，置20 mL顶空进样瓶中，加盖密封，置自动进样器上，按“2.4”项下条件进行检测分析，平行6次。结果（表2）在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积的RSD最大值分别为0.25%、3.25%，表明仪器精密度良好。

表2 精密度、重复性、稳定性考察结果(n = 6)

2.5.2 重复性考察 取同一批样品，按“2.1.2”项下方法制备6份供试品粉末，分别精密称定粉末0.3 g，置20 mL顶空进样瓶中，加盖密封，置自动进样器上，按“2.4”项下条件进行检测分析，平行6次。结果（表2）在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积的RSD最大值分别为0.11%、2.57%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性考察 取同一供试品粉末0.3 g，置20 mL顶空进样瓶中，加盖密封，置自动进样器上。分别于0、4、8、12、16、24 h，按“2.4”项下条件进行检测分析。结果（表2）在2个色谱柱下7个共有峰的保留时间和峰面积的RSD最大值分别为0.22%、4.92%，结果表明供试品粉末在24 h内稳定性良好。

2.6 温郁金电子鼻检测

按“2.4”项下Heracles NEO最佳检测条件对生、醋温郁金各10批样本进行检测，每批平行3次。

2.7 温郁金粉末气相色谱图

Heracles NEO具有非极性色谱柱MXT-5和中极性色谱柱MXT-1701，扣去空白参考后，生、醋温郁金粉末色谱图见图1。

2.8 温郁金气味差异标志物分析

采用正构烷烃标准溶液（C6～C16）进行校准，将保留时间转化为保留指数，然后通过Kovats保留指数定性，在Arochembase数据库中对化合物进行定性分析[11]。图1和表3结果表明，生温郁金表征出15个气味成分，而醋温郁金表征出17个气味成分。其中生、醋温郁金共有气味成分有15个，为异丙醇、月桂烯[12]、β-蒎烯[13]、γ-松油烯[12]、芳樟醇[13]、樟脑[13]、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇[12]、庚基苯、乙酸癸酯、β-石竹烯[13]、α-瑟林烯[13]、月桂酸甲酯、灭线磷、二糠基二硫、肉桂酸丁酯等，其中月桂烯、芳樟醇、β-石竹烯、肉桂酸丁酯具有辛辣气味，这与其传统气味描述一致；而醋温郁金新增2个气味成分，分别为丙醛、2,3-二氯-1,4-萘醌。通过对照品进行所识别的气味成分色谱图验证，明确2号和6号色谱峰是异丙醇和芳樟醇，结果与Arochembase数据库匹配一致。

图1 生、醋温郁金粉末气相色谱图

表3 温郁金中可能化合物及感官描述信息

Table 3 Possible compounds and sensory description information in

“+”表示检出成分，“−”表示未检出成分，*表示该成分经对照品识别后确认

“+” indicates the detected component, “−” indicates that the component is not detected; * indicates that the component is confirmed after being identified by reference substance

2.9 多变量统计分析

2.9.1 PCA 将Heracles NEO所分离的色谱峰作为影响因子，建立PCA模型，得出主成分1（PC1）、主成分2（PC2）和主成分3（PC3）的累积贡献率90.828%（图2），能较好地反映生、醋温郁金中气味信息。由图2可知，在PCA模型中，生、醋温郁金可明显分为2个区域（正方形为生温郁金，三角形为醋温郁金），表明生、醋温郁金之间存在较大的气味差异，PCA能准确识别温郁金不同炮制品。

2.9.2 DFA DFA以PCA为基础，缩短组内样品的间距，增大组间的距离[11]。因此，采用DFA对各批次生、醋温郁金进行分析，判别因子100%和验证得分97（图3），表明DFA能更好地显示出生、醋温郁金之间的气味差异，且进一步验证了PCA结果。由图3可知，在DFA模型中，2区域（正方形为生温郁金，三角形为醋温郁金）之间没有重叠的部分，且相距较远，说明Heracles NEO可快速识别生、醋温郁金。

图2 温郁金的PCA图

图3 温郁金的DFA图

2.9.3 VIP 以18个色谱峰的峰面积为变量，采用Simca-P14.1软件构建生、醋温郁金的OPLS-DA模型，分析得18个色谱峰的VIP值如图4所示，VIP值越大，表明该色谱峰对于生、醋温郁金的分类贡献越大，也即为最能导致生、醋温郁金相区分的差异成分。其中MXT-5色谱图的VIP值大于1.0的有4个色谱峰，按VIP值大小依次为1、5、10、6号色谱峰；MXT-1701色谱图的VIP值大于1.0的有5个色谱峰，按VIP值大小依次为5、9、6、10、12号色谱峰。因此，5、6、10号色谱峰可能是导致生、醋温郁金相区分的差异成分。

图4 生、醋温郁金OPLS-DA模型中18个色谱峰的 VIP值

3 讨论

温郁金含有较多的挥发性成分，辛香气味强烈，但对其气味感官描述仍停留在传统经验评价，具有主观性、经验性、模糊性，缺乏客观量化的评价方法。Heracles NEO作为新兴现代仿生技术，具有样品前处理简单、仪器操作简单、检测速度快、环境污染小，且能提供被测样品的综合气味信息，可应用于中药的气味分析、快速鉴别和质量控制等领域[8]。因此，该研究通过Heracles NEO采集各批次样品粉末的气味数据，结果表明生、醋温郁金可能成分及感官描述信息基本相同。生温郁金有15个色谱峰，其可能为异丙醇、β-蒎烯、月桂烯等气味成分，其中β-蒎烯具有杀菌抗炎等药理作用[14]；月桂烯具有抗氧化等药理作用[15]；芳樟醇常用作芳香剂和调味剂，并且有抗菌抗炎、抗肿瘤、抗高血压等药理作用[16]；β-石竹烯具有抗炎镇痛、保护神经、抗肿瘤、保肝等药理作用[17]。

与生温郁金相比，醋温郁金新增了1、18号色谱峰，且5、6号等7个色谱峰所代表的气味成分相对含量升高，这些可能是导致生、醋温郁金相区分的差异成分。通过生、醋温郁金OPLS-DA模型中VIP值分析18个色谱峰的分类贡献度，结果表明，在MXT-5和MXT-1701色谱柱下，5、6、10号色谱峰的VIP均＞1.0，因此，推测γ-松油烯、芳樟醇、乙酸癸酯可能是导致生、醋温郁金相区分的差异成分。这些气味成分的变化可能与醋制过程中的成分转化密切相关。醋中含有酯类、醇类、醛类和有机酸类等成分[18]，通过Heracles NEO对实验中使用的恒顺镇江香醋进行气味成分分析，结果表明其可能的气味成分有乙醛、乙醇、丙烯醛、2-甲基-2-丙醇、乙酸甲酯丁烷-2,3-二酮、2-丁醇乙酸乙酯、2-丁醇、醋酸乙酯、乙偶姻、反式-2-丁烯酸乙酯、糠醛、2-甲基丁酸、甲硫醇、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、己酸、醋酸。在醋制过程中，醋中的丙烯醛可能发生加氢反应生成丙醛；温郁金中的β-蒎烯和醋中的乙醇可反应生成γ-松油烯；温郁金中的β-蒎烯在高温条件下转化为月桂烯，再经过一系列反应生成芳樟醇；醋中的乙醛、乙醇等分别经过一系列反应生成乙烯，乙烯经控制聚合后再经水解、分离得癸醇，乙烯还可与醋酸、氧气在气相中反应生成醋酸乙烯，而癸醇与醋酸乙烯可反应生成乙酸癸酯。综上，推测γ-松油烯、芳樟醇、乙酸癸酯是生、醋温郁金的潜在气味差异标志物。

在所有气味成分中（表3），有芳樟醇等5个辛辣气味成分，这与其传统性味鉴别描述一致。此外，通过多变量统计分析（图2），Heracles NEO实现了生、醋温郁金快速识别，将其应用于生产实际，可对温郁金炮制过程进行在线、准确的气味质量控制，保证温郁金不同炮制品的气味质量稳定，体现其重要的应用价值。该研究中表征的灭线磷、2,3-二氯-1,4-萘醌等成分，是否为外源性农残物质，需后期收集不同产地或不同基原的温郁金样品以及相应对照品进行验证，采用新的统计学分析进一步完善温郁金气味成分数据库和质量控制体系，逐步将此技术普及于中药饮片企业的工业化生产及质量控制中，推动中药饮片产业的良性发展。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Rapid identification of odor difference markers inbefore and after vinegar with processing based on ultrafast gas chromatography electronic nose

QIN Yu-wen1, FEI Cheng-hao1, SU Lian-lin1, JI De1, LI Yu1, ZHANG Wei1,2, JIANG Liang-yu1, MAO Chun-qin1,3, LU Tu-lin1,3

1.School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2.School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 3.Jiangsu Provincial Engineering Research Center of TCM External Medication Development and Application, Nanjing 210023, China

In order to establish an effective and fast recognition method based on odor, Heracles Neo ultra-fast gas chromatography electronic nose was used to study the rapid identification of odor difference markers inbefore and after vinegar with processing.Through the establishment of Heracles Neo detection method for rawpieces and vinegarpieces, combined with arochembase database, principal component analysis (PCA), discriminant factor analysis (DFA) and variable importance in the projection (VIP) were used to process and analyze the chromatographic peak data.According to Heracles Neo, there were 18 chromatographic peaks inpieces, 17 odor components were characterized by arochembase database.PCA and DFA could distinguish raw and vinegarpieces accurately.Through the analysis of VIP value in opls-da model, the VIP of No.5, No.6 and No.10 chromatographic peaks were > 1.0 under MXT-5 and MXT-1701 chromatographic columns.Therefore, it was speculated that γ-terpinene, linalool and decyl acetate are potential odor markers of raw and vinegarRhizoma pieces.Heracles Neo can be applied to the rapid identification of odor difference markers in raw and vinegarpieces, which has important application value.

; processing with vinegar; Heracles NEO; odor difference markers; rapid identification; γ-terpinene; linalool; decyl acetate

R283.6

A

0253 - 2670(2022)05 - 1313 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.004

2021-07-06

国家重点研发计划项目（2018YFC1707000）；国家自然科学基金项目（81973483）

秦宇雯，博士研究生，研究方向为中药炮制。Tel: 15951875721 E-mail: 1343991665@qq.com

通信作者：陆兔林，博士，教授，主要从事中药炮制及中药饮片质量标准研究。Tel: 13951636763 E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

毛春芹，女，正高级实验师，主要从事新药研发及药物制剂研究。Tel: 13851500946 E-mail: 300555@njucm.edu.cn

#共同第一作者：费程浩，男，博士研究生，主要从事中药炮制机制研究。Tel: 15295516587 E-mail: feichenghao108@163.com

[责任编辑 郑礼胜]