碳点荧光探针的制备及其检测金银花中绿原酸含量的研究

李晚谊，李 宏，李秋兰，杨德志，杨亚玲*

碳点荧光探针的制备及其检测金银花中绿原酸含量的研究

李晚谊1，李 宏2，李秋兰3，杨德志3，杨亚玲3*

1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205 2.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650033 3.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500

以氯、氮掺杂碳点（Cl/N-CDs）为荧光探针，基于Cl/N-CDs和绿原酸之间的内滤效应，猝灭Cl/N-CDs的荧光，建立了绿原酸荧光检测新方法。以氯化胆碱与尿素形成的低共熔溶剂及柠檬酸为原料，通过一步水热法完成碳点制备，并通过透射电子显微镜，紫外-可见分光光度法，红外光谱，X射线衍射，X射线光电子能谱和荧光对其光学性能、形貌及相关基团进行表征。绿原酸在0.47～62.70 μg/mL对Cl/N-CDs的荧光猝灭呈良好的线性关系，用于金银花提取液中绿原酸的检测，其检出限可达到36 ng/mL。在绿原酸不同提取方法中，以氯化胆碱/尿素低共熔溶剂作为提取剂时对金银花中绿原酸的提取效率最高。以低共熔溶剂作为碳点制备原料和绿原酸提取溶剂，可实现绿原酸的提取和检测的双重作用，为金银花的质量评价提供新的研究思路。

绿原酸；金银花；氯、氮掺杂碳点；荧光探针；低共熔溶剂

金银花作为忍冬科忍冬属植物忍冬Thunb.双子叶植物的花蕾或带初开的花，具有疏热散风、清热解毒的药理作用[1-3]，被称为“中药抗生素”。绿原酸属于多酚类化合物，是金银花中起抗菌、抗炎、抗病毒药理作用的有效成分之一[4-5]。《中国药典》2020年版及ISO标准21317-2019规定，金银花中绿原酸≥1.5%[6-7]。迄今为止绿原酸含量的检测以HPLC法[8]、荧光光谱法[9]和近红外光谱法[10]等为主要手段[11-14]，其中荧光光谱法由于具有便于操作、耗时短、灵敏度高、低成本等优点，受到了广大研究者的关注[15-16]。

碳点（carbon dots，CDs）是一类新型碳纳米材料，其直径小于10 nm，且可以通过在其表面修饰不同的官能团来改变其物理化学性能，元素掺杂形成新的表面形态可以捕获激发电子，使得碳点的量子产率及其性能得到显著提升[17-19]。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）是指由季铵盐等（氢键受体）和羧酸、多元醇等（氢键给体）根据一定的化学计量比组合而成的凝固点比原料熔点低的低共熔混合物，又称共晶溶剂。项目组前期研究表明，DES具有良好的萃取性能[20-21]，同时以DES为原料制备的碳点又具有高的荧光产率及抗菌效能[22]。因此，研究以DES作为原料制备碳点，具有一定的研究价值。

碳点具有荧光强度高和稳定性好的优点，在紫外光的照射下可以发出强烈的荧光，使其在很多领域中都有广阔的应用前景。李志英等[23]以甘露糖为原料，采用热解法制备的柠檬酸修饰的荧光碳点，可以实现样品中总黄酮的分析检测（以芦丁计）。徐源等[24]探讨了利用碳点建立可用于鹿茸中活性物质测定技术的可行性分析。周巳祺等[25]以荧光碳点作为探针，建立一种简便灵敏的测定中药大黄素的方法。罗康[26]以黄铁矿和氟化钙作为纳米材料实现了中药中杂质的荧光检测。所以，碳点在实现中药中成分快速检测前景广阔。

本研究是以氯化胆碱和尿素形成的DES及柠檬酸为原料，通过一步水热法合成氯、氮掺杂碳点（Cl/N-CDs）。基于Cl/N-CDs和绿原酸之间的内滤效应，建立了绿原酸荧光检测新方法（如图1所示）。为了对金银花中绿原酸进行精确检测，研究采取不同溶剂（水、乙醇及DES）对金银花中的绿原酸进行提取。通过使用本方法和HPLC法检测检测提取液中绿原酸，结果证明本方法可信度较高。此外，共存物干扰实验也证明，本方法具有优异的抗干扰能力（共存的其他多酚、有机酸等成分对探针几乎无干扰）。

1 仪器与材料

1.1 仪器

GS800A分子荧光光谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司；TENSOR27型傅立叶红外光谱分析仪，德国Bmker公司；Bruker D8 Advance型X射线衍射仪，德国Bruker公司；TU-1901紫外-可见双光束分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；XW-800快速混匀器，上海汗诺仪器有限公司；pHS-3B精密酸度计，德国赛多利公司；HC-3018R型高速离心机（转头型号H0650），安徽中科中佳科学仪器有限公司；120 mL聚四氟乙烯内衬水热反应釜，上海-凯实验仪器有限公司；Tecnai G2 TF30场发射透射电子显微镜，荷兰FEI公司。

图1 基于绿原酸对Cl/N-CDs荧光猝灭传感器示意图

1.2 试剂

氯化胆碱（批号C106702276）、尿素（批号2150820）、柠檬酸（批号20200720）购于上海国药集团化学试剂公司，质量分数均大于98%；硫酸奎宁（批号H1623052）、绿原酸（批号CHB190121）、异绿原酸A（批号CHB180921）、异绿原酸C（批号CHB180925）购于上海阿拉丁生化科技有限公司；无水乙醇（批号20211101329）购买自上海易恩化学技术有限公司；KCl（批号20200820）、NaCl（批号20201020）、MgCl2（批号20171009）、ZnCl2（批号20140320）、CaCl2（批号20130602）、CuCl2（批号20130509）、棕榈酸（批号20140510）、阿拉伯酸（批号20131110）、-葡萄糖（批号20100801）、甘氨酸（批号F20120616）、半胱氨酸（批号F20090415）、抗坏血酸（批号20180402）购自上海麦克林生化科技有限公司，质量分数均大于99%；金银花由云南中医药大学陈林兴教授鉴定，为忍冬科忍冬属植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，购买于云南中药材批发市场；实验用水均为去离子水，美国Milli-Q Academic超纯水系统。

2 方法

2.1 Cl/N-CDs的合成

将氯化胆碱与尿素按物质的量比1∶1（氯化胆碱-尿素2.8∶1.2）混合之后，于100 ℃油浴，磁力搅拌至固体颗粒完全熔解为透明液体，该透明液体即DES[27]。将1.9 g柠檬酸和100 mL去离子水与低共熔溶剂混合，完全溶解后，转移至聚四氟乙烯罐中，置于马弗炉180 ℃条件下反应8 h。随后将其从马弗炉中取出，放置于室温自然冷却。得到的棕色溶液先离心（10 000 r/min、15 min），再用0.22 μm滤膜滤过，即得氯、氮双元素掺杂的碳点（Cl/N-CDs），于4 ℃下储存备用。取1 mL Cl/N-CDs于烧杯中，烘干后称定质量，扣除烧杯质量后，即得Cl/N-CDs的质量浓度为23 mg/mL。

2.2 量子产率及光学特性

Cl/N-CDs的量子产率参照文献方法[28]进行计算。用0.1 mol/L H2SO4溶液溶解硫酸奎宁作为标准溶液使用（其荧光量子效率为54%），Cl/N-CDs的量子产率（）按以下公式计算。

＝RSRS2/(RSR2)

表示吸光度，表示溶剂的折射系数（其中S2/R2＝1，R和S分别表示参比硫酸奎宁和样品），表示荧光强度

对材料光学特性的研究通过紫外和荧光仪器实现，具体如下：用1.6 mg/mL的Cl/N-CDs稀释溶液测定其紫外特征吸收峰。荧光仪上在激发波长为280～360 nm，狭缝宽度均为5 nm时检测其荧光发射随激发波长的位移情况。

2.3 荧光探针测定绿原酸的方法

量取8 mL合成的Cl/N-CDs用去离子水稀释至115 mL，得到质量浓度为1.6 mg/mL的Cl/N-CDs稀释溶液，用作荧光强度检测的工作液。一般过程中，量取0.5 mL的Cl/N-CDs稀释溶液和0.5 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH 7），加入20 μL不同质量浓度的绿原酸标准溶液后，用去离子水稀释至4 mL。涡旋混匀后，室温下放置反应5 min。最后在324 nm的激发波长下测定402 nm处的荧光强度。

考察不同乙醇体积分数、NaCl浓度、pH值、温度及共存物质对荧光探针的影响。

2.3.1 乙醇体积分数 量取0.5 mL的Cl/N-CDs稀释溶液，用不同体积分数的乙醇（0、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%）稀释至4 mL后，在324 nm的激发波长下测定402 nm处荧光强度的变化。

2.3.2 NaCl浓度 量取0.5 mL的Cl/N-CDs稀释溶液，用不同浓度的NaCl（50、100、150、200、250、300、350、400、450 mmol/L）稀释至4 mL后测定402 nm处荧光强度的变化。

2.3.3 pH值 在pH 2～10时检测Cl/N-CDs荧光强度变化。

2.3.4 温度 在5～65 ℃时检测Cl/N-CDs荧光强度变化。

2.3.5 共存物质 分别考察可能存在的共存物质K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、棕榈酸、阿拉伯酸、葡萄糖、甘氨酸、半胱氨酸、抗坏血酸及异构体质量浓度为6 mg/mL时对60 μg/mL的绿原酸荧光猝灭效果的影响。

2.4 样品的提取

精确称取3份5 g金银花粉末置于圆底烧瓶中，3份样品中再分别加入100 mL的DES（氯化胆碱/尿素）、去离子水和60%乙醇[29]作为提取剂，超声（25 ℃、功率120 W）提取120 min后，8000 r/min离心15 min，取上层清液，测定绿原酸含量。

2.5 HPLC法验证方法准确性

2.5.1 对照品测试 分别取20 μL不同质量浓度的绿原酸标准溶液，注入HPLC系统分析，测定相对应质量浓度下绿原酸的峰面积。以绿原酸质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（），绘制标准曲线为＝23.282－47.625，2＝0.996 4，线性范围4～1000 μg/mL。与此同时，取样品提取液20 μL，在相同色谱条件下，通过HPLC法测定不同提取剂条件下提取的待测液中绿原酸含量。

2.5.2 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液（13∶87）；体积流量为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为20 μL；检测波长为327 nm。

3 结果与分析

3.1 Cl/N-CDs的表征

图2-a为Cl/N-CDs的X射线光电子能谱（XPS）图。图中283.8、398.3、531.0 eV 3个主峰，分别对应于C1s、N1s和O1s。C1s的高分辨率谱图（图2-b）可分为283.8、284.7、285.7、287.2 eV 4个峰，分别对应于C＝C、C-O、C-N、C＝O。图2-c显示的N1s高分辨率谱图在398.2、399.7 eV处有2个典型的峰，分别对应于N-C和N-H。O1s的高分辨率谱图（图2-d）可以分解为530.3、531.1、532.3 eV处的3个峰，分别对应O-H、C＝O、C-O。

图3-a为Cl/N-CDs的透射电子显微镜（TEM）图，从图中可以看出，所制备的Cl/N-CDs呈现类球形，分散性较好，且尺寸大小在5 nm左右。Cl/N-CDs排列为晶格条纹，相邻晶格间的间距为0.24 nm。图3-b为Cl/N-CDs的红外光谱（FI-IR）图。从图中可以看出，3259、3430、2950 cm−1处的较强峰各自与N-H、O-H和C-H的伸缩振动相关联，C＝O和C＝C的伸缩振动归因于1649 cm−1处的峰，1400 cm−1归因于C-N键的伸缩振动，而1089 cm−1附近的峰来源于C＝O键的伸缩振动[30]。

3.2 Cl/N-CDs的光学性能

图4-a中的2条谱线分别为Cl/N-CDs的荧光激发谱线（红线）和荧光发射谱线（蓝线）。如图中所示，可以看出Cl/N-CDs的最大激发在324 nm，最大发射峰在402 nm处。Cl/N-CDs水溶液在自然光下接近无色，在365 nm的紫外光照射下呈现出明亮的蓝色荧光。图4-b则是在不同的激发波长下Cl/N-CDs的荧光发射峰。而且激发波长的改变不会改变发射峰的位置，表明Cl/N-CDs尺寸的均匀性和表面状态的稳定性。

图2 Cl/N-CDs的XPS全谱图(a) 及C 1s (b)、N 1s (c) 和O 1s (d) 的高分辨谱图XPS谱图

图3 TEM图(a) 和FTIR谱图(b)

图4 绿原酸的UV-vis吸收光谱和Cl/N-CDs的FL光谱(a) 及Cl/N-CDs在不同激发波长下的荧光发射光谱(b)

材料荧光量子产率的测定采用相对荧光量子产率测定法，以硫酸奎宁作为标准溶液，计算得到Cl/N-CDs荧光量子点产率为37%。此外，研究考察了不同5个批次下Cl/N-CDs的荧光强度变化，结果表明Cl/N-CDs荧光强度相对标准偏差在±2.13%以内。

3.3 荧光探针测定绿原酸的条件优化

考察了乙醇、NaCl、pH值和反应温度对Cl/N- CDs测定绿原酸的影响（图5）。结果表明，不同乙醇体积分数、NaCl浓度、pH值在6～8及温度35～55 ℃时，Cl/N-CDs的荧光强度基本不变，Cl/N-CDs具有较好的稳定性、耐盐性等特性，对酸碱度和乙醇具有较强的抗干扰能力。

3.4 Cl/N-CDs荧光猝灭测定绿原酸

绿原酸在0.47～62.70 μg/mL时，Cl/N-CDs荧光的猝灭程度（图6-a）与反应液中加入的绿原酸质量浓度之间呈现良好的线性关系（图6-b）：(0－)/0＝−12.437 89＋925.388 23，2＝0.992 48。其中0和分别为加不同质量浓度绿原酸前后Cl/N-CDs的荧光强度，为绿原酸的质量浓度。检出限根据3/计算，为36 ng/mL（为空白样品的标准偏差，为线性校准曲线的斜率）。

3.5 荧光猝灭机制的研究

Cl/N-CDs的荧光光谱和绿原酸的紫外吸收光谱如图4-a所示，绿原酸在236、334 nm处有2个UV-vis吸收光谱（黑线）特征吸收峰，Cl/N-CDs的激发和发射波长分别为324、402 nm。从图4-a中可以看出，绿原酸的紫外特征吸收峰与Cl/N-CDs的激发、发射峰有很大程度重叠，故而推测绿原酸对Cl/N-CDs产生荧光猝灭的机制为内滤效应。

3.6 荧光探针对绿原酸测定的选择性

研究考察了金银花样品中可能存在的共存物质对荧光探针体系的影响。如图7所示，以Cl/N-CDs为空白，其他实验组中加入等量Cl/N-CDs和绿原酸，并分别加入K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、棕榈酸、阿拉伯酸、葡萄糖、甘氨酸、半胱氨酸、抗坏血酸。由图7可知，以上几种可能与绿原酸共存于金银花基体中的成分对测定基本没有干扰。绿原酸异构体对碳点荧光干扰的研究表明，异绿原酸A和异绿原酸C的质量浓度高于绿原酸质量浓度5倍时有一定荧光猝灭效果。考虑到实际金银花样品中异构体和金属离子的实际浓度，该结果表明本方法具有较好的抗干扰效果。

图5 乙醇体积分数(a)、NaCl浓度(b)、温度(c)、pH值 (d) 对Cl/N-CDs荧光强度的影响

图6 不同绿原酸质量浓度和Cl/N-CDs的荧光光谱(a) 及线性曲线(b)

3.7 不同提取方法对金银花中绿原酸测定的影响

为了实现对实际金银花样品中绿原酸的精确检测，并选出对荧光分析干扰小甚至没有干扰的提取试剂，探究了3种不同提取试剂提取对实际绿原酸提取检测结果的影响，结果见表1。结果表明，用氯化胆碱/尿素DES提取效果最好，测定的绿原酸含量最高，60%乙醇提取效果其次，水提取效果最低。此外，DES自身也具有一定的荧光，如图8-a所示，但其最大m＝420 nm，x＝500 nm，并不会对绿原酸的荧光测定产生干扰。

图7 共存物质对荧光探针体系的影响

表1 金银花样品中绿原酸的含量测定比较(, n = 5)

Table 1 Determination of chlorogenic acid content in LJF samples (, n = 5)

表1 金银花样品中绿原酸的含量测定比较(, n = 5)

提取方法添加量/(mg∙g−1)荧光探针HPLC法 绿原酸/(mg∙g−1)回收率/%绿原酸/(mg∙g−1)回收率/% DES法026.80±10.79−27.00±11.82− 2046.50±12.0098.546.70±13.3898.5 4065.40±13.7396.566.90±14.9099.8 醇提法021.30±11.75−21.50±15.05− 2040.90±11.1398.041.30±10.1799.0 4060.40±11.5197.861.10±12.0099.0 水提法011.60±12.71−12.10±9.73− 2031.40±11.7599.031.90±11.2999.0 4051.90±16.97100.852.00±12.5599.8

由于提取液颜色较深无法直接使用紫外方法测定（图8-b），药典方法中需要通过色谱柱分离。本研究以建立的荧光探针方法测定提取液中绿原酸，方法加样回收率在96.5%～100.8%，结果也表明用本法测定金银花样品的绿原酸含量精密度高、稳定性好，且几乎无干扰存在。为了验证方法的准确性，研究以HPLC方法对相同样品进行了测定，对比结

图8 DES的荧光激发和发射光谱(a)、不同提取液的紫外吸收光谱图(b)、DES和60%乙醇提取液的色谱图(c)、不同提取液图片(d)

果较一致。虽然本方法依然需要使用较多萃取剂提取绿原酸，但与HPLC法相比（图8-c），该方法借助酶标仪可以实现高通量检测，操作简便、快速、成本低廉。HPLC法检出限根据3/计算为1.4 mg/kg，远高于本方法，此外，借助酶标仪检测，检测时间可以从HPLC法的5 min缩短至几秒钟范围内，相对比之下，仪器运行和测定成本也很低，具有很好的应用推广价值。

4 讨论

4.1 荧光探针条件优化

本实验分别考察了乙醇体积分数（0～100%）、NaCl浓度（0～450 mmol/L）、pH值（2～10）和反应温度（5～65 ℃）4种不同条件下，对Cl/N-CDs的荧光和荧光探针检测体系的影响，结果表明Cl/N-CDs的荧光和荧光探针检测影响较弱，证明了基于Cl/N-CDs的荧光探针检测体系具有较强的抗干扰能力。

4.2 荧光探针测定猝灭机制及其选择性

通过测定Cl/N-CDs的荧光光谱和绿原酸的紫外吸收光谱，对比二者谱图见的差异性，实验结果发现绿原酸的吸收峰与碳点的激发峰存在很大一部分的重叠。根据此现象，可以推测Cl/N-CDs与绿原酸之间的荧光猝灭效果主要基于内滤效应，且其荧光猝灭效果与绿原酸含量成正比。

在检测体系种加入7种金属离子、6种可能共存的物质以及绿原酸的异构体，通过测定其对碳点的荧光强度影响效果。最终发现绿原酸对体系的荧光具有非常显著的荧光猝灭效果，绿原酸的异构体仅具有非常微弱的荧光猝灭效果。结果表明该荧光探针对于绿原酸的测定具有非常强的选择性。

4.3 金银花样品的测定分析

研究以3种不同的提取液，分别提取金银花中的绿原酸，结果表明以氯化胆碱/尿素制备的DES萃取剂对绿原酸萃取效果最好，且其提取液颜色最浅。从色谱图上可以看出，在一定程度上DES作为萃取剂可以降低干扰，且DES的荧光不会对检测体系产生干扰。方法的加样回收率在96.5%～100.8%，与HPLC方法测定的结果相一致。

5 结论

本研究建立了一种耐盐、耐酸碱、耐醇及高温的可检测绿原酸的荧光探针。方法具有准确性好、抗干扰能力强的特点，可用于实际金银花中绿原酸的提取和含量测定。利用荧光探针技术，可以实现金银花中绿原酸的快速分析测定，可为中药质量评价提供新的研究思路和分析策略。

此外，关于Cl/N-CDs与绿原酸选择性荧光猝灭的作用机制，还需要进一步研究。探究碳点与绿原酸的作用机制，对于建立高选择性的荧光探针技术具有重要的指导意义，同时也可为其他探针技术的开发提供技术支持。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Preparation of carbon dot fluorescent probes and study on determination of chlorogenic acid in

LI Wan-yi1, LI Hong2, LI Qiu-lan3, YANG De-zhi3, YANG Ya-ling3

1.Research Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China 2.Research Institute of Product Processing, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650033, China 3.Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Technology, Kunming 650500, China

In this study, chlorine and nitrogen doped carbon dots (Cl/N-CDs) were used as fluorescent probes.Based on the internal filtration effect between Cl/N-CDs and chlorogenic acid to quench Cl/N-fluorescence of CDs, a new method for fluorescence detection of chlorogenic acid has been established.The Cl/N-CDs was synthesized by one-step hydrothermal method using the eutectic solvent formed by choline chloride/urea and citric acid as raw materials.The optical properties, morphology and related groups of Cl/N-CDs were characterized by TEM, UV-vis, FT-IR, XRD and XPS.In the range of 0.47—62.70 μg/mL, the fluorescence quenching of Cl/N-CDs by chlorogenic acid showed a good linear relationship, and the detection limit of chlorogenic acid in the extract could reach 36 ng/mL.Among the different chlorogenic acid extraction methods, choline chloride/urea eutectic solvent used as the extractant has the highest extraction efficiency for chlorogenic acid in(LJF).The eutectic solvent is used as the raw material for carbon dot preparation and the chlorogenic acid extraction solvent, which can play the dual role of chlorogenic acid extraction and detection, and provide new research ideas for the quality evaluation of LJF.

chlorogenic acid;; chlorine and nitrogen doped carbon dots; fluorescent probe; eutectic solvent

R283.6

A

0253 - 2670(2022)05 - 1402 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.015

2021-09-04

云南省科技厅重大科技专项（202002AE320006-02-060）；云南主要外销蔬菜绿色关键技术研究和集成示范（2019ZG001-3）；云南特色水果品质提升与优势品牌创建（2019ZG002）；农产品加工团队培育（202002AE320007-03）

李晚谊（1965—），女，云南昆明人，研究员，主要从事食品加工及食品安全等方面的研究。

通信作者：杨亚玲（1964—），女，云南昆明人，教授，主要从事分析化学等方面的研究。

[责任编辑 郑礼胜]