航天复合应激环境模型大鼠大脑皮层形态及蛋白表达的变化

武晓瑞， 尹一淑， 刘军莲， 范全春， 赵 爽， 李勇枝*

(1.中国航天员科研训练中心， 北京 100094； 2.哈尔滨工业大学食品科学与工程系， 哈尔滨 150001)

1 引言

航天环境下的应激因素是多方面的，如超重、失重、噪声、辐射和昼夜节律改变等物理应激源，血液重分布、肌肉废用和骨质丢失等生理性应激源，空间狭小、社会隔离、限制、睡眠剥夺、工作高负荷、高危险等心理应激源，乘员异质性、性格冲突、文化与性别差异、人际摩擦等人际应激源。 这些应激因素产生的一系列反应均影响着乘员的心理和生理健康，影响飞行任务的完成，甚至可能造成灾难性后果。

Bremner研究表明，慢性应激引起下丘脑－垂体－肾上腺轴(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis， HPA axis)功能长期异常，糖皮质激素持续处于高水平导致神经干细胞增值受到抑制，神经元受损萎缩引起神经结构和功能损伤。 陈海龙等检测了尾吊一周SD 大鼠脑区记忆相关蛋白表达情况，发现海马区学习相关蛋白通路活化能力减弱；Iqbal 等通过比较O16/O18 标记的综合蛋白质组学策略，检测了7 d 尾吊大鼠模型的差异蛋白表达情况，发现了132 个差异表达蛋白，其中25 个蛋白与各种信号级联相关并且涉及重要的内稳态功能，表明微重力环境对脑部信号传递产生了一定的影响。 因此长期处于航天应激环境下会引起机体中枢神经系统内的生化改变，出现情绪异常，甚至导致大脑器质性损害。 而与情绪密切相关的是大脑皮层和边缘系统，在应激反应中是高位调节中枢，更是应激反应最容易累积的敏感区域。

近年来有关航天复合应激的实验研究很少公开发表。 抗体芯片技术是一种高通量技术，能够利用少量样品筛选差异表达蛋白，全面、定量地分析蛋白种类和数量的改变，并且通过结合生物信息学方法进行分析，即可预测航天应激环境的影响机制。 本文通过神经组织形态学、抗体芯片检测技术及通路富集分析，对模拟长期航天应激环境下大鼠大脑皮层及相关蛋白表达的变化进行探究，为进一步探究航天复合应激环境对大鼠大脑皮层的影响提供实验依据。

2 方法

2.1 动物与试剂

实验选用健康成年6 周龄雄性SD 大鼠，SPF级，体重(200±10)g，由军事医学科学院实验动物中心提供。 实验动物购入后，适应性常规饲养一周。

主要试剂:尼氏染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)；PBS(美国Hyclone 公司)；RIPA裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)；KAM－850 antibody microarray 试剂盒(加拿大Kinexus公司)；发光液(美国Millipore 公司)；辣根酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；GAPDH 抗体(sc－47724)(美国Santa Cruz 公司)；BDNF (ab75040)(美国Abcam 公司)；PI3K(4249)、 p-PI3K (2971)、 AKT (9272)、 p-AKT(9271)、mTOR (2983)、p-mTOR (2971)、GSK－3β(9315)、p-GSK－3β(9336)、CREB (9197)、p-CREB (9198)、JNK(3708)、p-JNK (4668)、p38(8690)、p-p38 (4511)(美国CST 公司)。

主要器材:全自动真空脱水机、组织包埋机、石蜡切片机、载玻片(德国Leica 公司)；荧光显微镜(日本Olympus 公司)；KAM－850 抗体芯片(加拿大Kinexus 生物信息公司)；激光阵列扫描仪(美国Perkin-Elmer 公司)；低温高速离心机(德国EPPENDORF 公司)；旋涡混匀器(北京六一仪器厂)；匀浆仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；超微量紫外分光光度计(美国Quawell 公司)；干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)。

2.2 动物分组与造模

大鼠随机分为2 组，分别为空白对照组(Control，Ctrl)与航天复合应激模型组(Model，Mod)，每组10 只。 其中，Ctrl 组每笼放入5 只大鼠，在正常条件下饲养，每日保持12 h 光照和12 h 黑暗昼夜交替。 模型组在模拟航天复合应激环境下饲养。 模拟航天复合应激条件包括:孤养、尾吊、噪声、昼夜节律改变。 每笼饲养1 只大鼠，可自由活动和进食水，尾吊笼四周安装毛玻璃，使笼中大鼠不能看到外部，造成相对幽闭隔离的环境。 采用改进的尾部悬吊法使大鼠躯体与水平呈30°角，后肢悬垂不碰触地面。 动物房的四角各放置1 个扬声器，用白噪声发生器发出稳态噪声，经均衡器、功率放大器传至扬声器，声强控制在(65±2)dBA 范围内，每天持续播放12 h。 利用微电脑时控开关设置照明为45 min 开和45 min 关交替，模拟近地轨道90 min 绕地一周的昼夜节律变化。造模时间共持续6 周。

2.3 尼氏染色观察大脑皮层形态

造模完成后，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠。 先用生理盐水灌注，待大鼠肝脏变白后，换成4%多聚甲醛灌流，直到大鼠肝脏变硬，尾巴僵硬为止。 大鼠断头处死，在冰上剥离全部大鼠大脑及皮层组织。 取4 只大鼠皮层组织放入4%的多聚甲醛溶液中，浸泡24 h 后漂洗、脱水、石蜡包埋并切片，余下的6 只用于后续抗体芯片分析及蛋白质免疫印迹检测。 将脑片置于焦油紫溶液中，室温下染色30 min。 放入Nissl Differentiation 中进行分化，在显微镜下观察至背景接近于无色为止。 另外，荧光显微镜下对皮层进行组织学观察及拍照，并对不同尼氏染色阳性神经元区域进行双盲计数。

2.4 抗体芯片筛选差异蛋白

取剩余6 只大鼠大脑皮层组织在冰浴中进行匀浆，并超声粉碎。 4 ℃环境下，离心转速为12 000 r/min，旋转10 min，取上清于1.5 mL 离心管中。 用紫外分光光度计测定样品蛋白浓度。 分装一半用于抗体芯片分析，其余用于蛋白免疫印迹分析。

用KAM－850 antibody microarray 芯片进行各组件无偏差信号蛋白特征分析。 将各组抽提后的蛋白质用试剂盒中提供的Cy5 和Cy3 两种不同颜色的荧光分子分别标记，洗去多余标记分子。将KAM－850 抗体芯片在封闭缓冲液中封闭1 h，在孵化缓冲液中将芯片与蛋白样品孵育2 h，用激光阵列扫描仪在540 nm 处扫描抗体芯片，搜索差异蛋白相对应的基因。 选用京都基因与基因组( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库的信号通路，采用超几何分布的计算方法，用错误发现率(False Discovery Rate，FDR)校正P-value，选取的阈值为0.05，最后获得差异表达基因显著富集的KEGG 信号通路。

2.5 蛋白免疫印迹分析

将加入上样缓冲液的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)。 电压80 V，30 min 左右时待条带跑至分离胶时，将电压改为120 V，继续进行90 min。剪取适合大小，厚度为0.22 μm 的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜，放入甲醇浸泡10 s，之后和滤纸、转膜夹、海绵一起浸泡于预冷的转膜液中进行转膜。 恒定电流300 mA，根据目标蛋白分子大小进行，电转60 ～90 min 后将PVDF 膜迅速放入封闭缓冲液中，室温封闭2 h，然后用TBST 洗膜5 min。 按照抗体说明书的稀释比例，用含1% BSA 的TBST 配置2 mL 一抗溶液。根据蛋白Marker 切下与目的蛋白相应的PVDF膜，放入一抗中，于4 ℃冰箱轻摇孵育过夜。 之后在TBST 中洗膜3 次，每次10 min。 用封闭缓冲液配制辣根过氧化酶标记的二抗孵育液，浓度1 ∶5000。 将PVDF 膜加入二抗孵育液中，室温下摇床孵育2 h。 之后在TBST 中洗膜4 次，每次10 min。将Millipore 发光液A 液和B 液按1 ∶1比例加入孵育盒中混匀，将待测PVDF 膜浸泡其中2 min，取出后放入化学凝胶成像系统中显影、曝光，并用Image J软件对条带进行灰度分析。

2.6 统计分析

所有数据均以均数±标准误表示，采用SPSS17.0 软件进行正态性分析和方差齐性检验，采用单因素方差分析进行多样本间比较，用Bonferroni 修正差别检验法进行两组间比较，并用GraphPad Prism 5 作图。

3 结果

3.1 大鼠大脑皮层形态

显微镜下对尼氏染色的大脑皮层组织切片进行观察，如图1 所示。 与Ctrl 组相比，Mod 组神经元数目减少，间隙变大，尼氏染色相对较弱。

图1 模拟航天复合应激对大鼠大脑皮层组织形态的影响Fig.1 Effects of simulated spaceflight composite stress on the morphology in cerebral cortex

对皮层神经元数目进行计数，并统计分析，见图2。 与Ctrl 组相比，Mod 组神经元数目显著减少(＜0.01)，提示模拟长期航天应激环境会造成大鼠大脑皮层神经元损伤(其中＜0.05 被认为差异有统计学意义)。

图2 模拟航天复合应激对大鼠大脑皮层神经元数目的影响Fig.2 Effects of simulated spaceflight composite stress on the numbers of intact neurons in cerebral cortex

3.2 大鼠大脑皮层蛋白表达

3.2.1 抗体芯片扫描图像

用激光阵列扫描仪对抗体芯片进行扫描，得到图3。 左侧为Ctrl 组皮层组织的扫描图像，右侧为Mod 组皮层组织的扫描图像。 其中，红色点表示丰度增加，绿色点表示丰度降低，红绿混合表示丰度没有变化。

图3 抗体芯片扫描图像Fig.3 Antibody-based protein microarray scanning images

3.2.2 抗体芯片检测蛋白变化

抗体芯片共检测了854 个蛋白分子。 根据Kinexus 公司的标准，同时满足Z-ratio ≥±1.5%，Error Range ≤30， Globally Normalized Median Value ≥271 和Flags ＝0 四个指标要求的分子才被认为发生了显著变化，其中Z-ratio 表示对照样品和处理样品之间的最大变化，Error Range 表示全局归一化网络信号强度的紧密程度，Globally Normalized Median Value 代表全局标准化中值，Flag 表示形态和背景的斑点质量。 结果发现大脑皮层组织中，Mod 组与Ctrl 组相比，显著差异蛋白有28 个，其中表达上调的有21 个，表达下调的有7 个，如表1 所示。

表1 大脑皮层Mod 组与Ctrl 组差异蛋白列表Table 1 Expressed differential proteins between Mod and Ctrl groups in cerebral cortex

3.2.3 抗体芯片检测差异蛋白的通路活性

通过搜索芯片差异蛋白相对应的基因，进行KEGG 通路富集分析，得出发生显著改变的信号通路。 图4 为大脑皮层组织显著改变的通路，轴表示为富集分析统计显著性值p value 进行－log转换后的值，且数值越大表示富集分析越显著。 Mod 组和Ctrl 组相比，变化较为显著的信号通路有脂肪细胞因子(Adipocytokine)、MAPK、p53等信号通路。

图4 模拟航天应激环境模型影响大脑皮层组织的信号通路Fig.4 Altered signaling pathways in different groups in cerebral cortex

3.3 Western Blot 验证差异蛋白

在抗体芯片中，Mod 组大脑皮层MAPK 信号转导通路活性发生了明显变化。 在哺乳动物机体内已发现的5 种MAPK 信号转导通路中，ERK1/2通路调控细胞生长和分化，JNK 和p38-MAPK 通路在炎症和细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。 为了证实这种变化，本文用免疫印迹法对MAPK 的3 个亚族ERK1/2、JNK 和p38-MAPK 进行了检测。

图5 为大脑皮层组织的免疫印迹检测结果，发现在大脑皮层组织中，与Ctrl 组相比，Mod 组ERK1/2、JNK 和p38-MAPK 的磷酸化水平发生微弱提高。 结果提示模拟长期航天飞行可能对MAPK 通路产生一定程度的影响。

图5 模拟航天应激环境对MAPK 通路关键蛋白表达的影响Fig.5 Effects of spaceflight composite stress on the expression of key proteins in the MAPK pathway

4 讨论

考虑到长期太空飞行特殊和复杂的极端环境，本文通过尾吊、时序变化、孤养、噪声因素模拟航天环境，建立慢性应激大鼠模型，致力于构建一个比较理想和全面的航天复合应激环境模型，能够更贴合地模拟空间站中环境，尽管如此，本模型仍旧具有一定的局限性，如难以模拟飞行乘组人员之间的人际关系等。

尼氏体是神经元的特征性结构，是蛋白质合成的场所，主要合成更新细胞器所需的结构蛋白、合成神经递质所需的酶类以及肽类等神经调质，结构异常与情绪抑郁、认知损害等症状密切相关。 郭纯等研究发现，慢性应激大鼠海马尼氏体减少，颜色变浅，细胞间隙增加。 本文用尼氏染色法观察模拟航天复合应激环境模型大鼠大脑皮层的神经元形态的改变。 结果发现模型大鼠大脑皮层神经元数量减少，结构有明显改变，提示模拟航天复合应激环境会造成大鼠皮层组织神经元损伤。

高通量蛋白质组学技术是在大规模水平上研究蛋白质，能预测生命活动规律的物质基础，为疾病机制的阐明提供理论依据和解决途径，还被广泛用来确定药物的细胞信号分子和靶标蛋白。 抗体芯片是最常用的蛋白质芯片中的一种，通过芯片上的抗体和待测样品中的抗原进行特异性免疫反应，实现一次检测成百上千种蛋白表达丰度。 其特异性强，敏感度高，已经广泛应用于医学、药学、生物学等多个领域。 本文研究应用抗体芯片技术检测模拟航天复合应激环境后大鼠大脑皮层的蛋白变化，发现有显著差异的蛋白28 个，其中21 个表达上调，7 个表达下调。接着利用KEGG 数据库进行了通路富集分析，发现了其中与神经系统相关的MAPK 信号通路变化较为明显。

MAPK 通路控制着细胞的多种生理过程，在信号网络中起重要作用。 ERK1/2 通路和p38－MAPK 通路都属MAPK 通路。 ERK 通路发挥促细胞生长及分化的作用，p38－MAPK 通路在应激反应中促细胞凋亡。 Li 等研究表明Ras/ERK/p38－MAPK 信号通路参与慢性应激抑郁模型大鼠神经可塑性和抑郁样行为的调节。 本文也对此通道上的多个蛋白进行了免疫印迹检测，发现其磷酸化水平均有提高的趋势。 因此可以合理推测，模拟航天复合应激环境会导致大鼠大脑皮层脑组织形态发生改变，也会影响皮层组织中相关蛋白的改变，这种改变可能是通过调节MAPK信号通路造成的。

5 结论

本文探究了航天复合应激环境对模型大鼠大脑皮层脑组织形态及相关蛋白的影响，结论如下:

1)模拟航天复合应激环境会造成模型大鼠皮层组织神经元损伤。

2)模拟航天复合应激环境后大鼠大脑皮层的蛋白发生明显变化，其中MAPK 和p53 通路的变化较为明显。