不同品种蓝莓果实品质特征和抗氧化能力及多酚组成的比较

熊 颖，禹 霖，柏文富，李建挥，严佳文，聂东伶，吴思政

（湖南省森林植物园，湖南 长沙 410116）

蓝莓为杜鹃花科Ericaceae 越橘属Vaccinium多年生灌木果树，果实中富含花色苷、多酚等活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节肠道菌群、增强视力等功效[1-6]，享有“浆果之王”的美誉。蓝莓果实芳香，酸甜可口，可食率高达100%，是一种理想的鲜食水果，亦可加工成各种休闲食品，具有很高的经济价值和广阔的发展前景。

目前国内外对蓝莓果实的研究主要集中在不同品种蓝莓的加工特性、抗氧化活性物质含量、抗氧化能力和抑菌能力等方面[7-10]，仅有少量关于蓝莓果实中糖类、有机酸和花色苷、酚酸、黄酮类物质组成分析的报道[11-17]，对于不同品种蓝莓果实中多酚组成的研究尚未见报道。湖南蓝莓研究发展中心从2008年开始蓝莓的引种栽培试验，先后从大连等地引进南高丛、北高丛和兔眼3 个系列共40 多个品种，对选育的适宜在湖南种植的‘灿烂’‘园蓝’等蓝莓良种进行推广种植，良种栽培推广面积超过1 300 hm2。目前本项目组已开展从蓝莓新品种选育、适生条件、测土配方，到采后保鲜、产品深加工的全产业链相关研究，但对不同品种蓝莓的果实品质特征、抗氧化能力以及多酚组成差异的研究涉及较少。本研究以湖南蓝莓研究发展中心天际蓝莓园兔眼系列的5 个品种蓝莓果实为试材，对5 个品种蓝莓果实的品质特征、抗氧化物质含量、抗氧化能力和多酚组成进行了比较分析，以期为湖南的蓝莓种植区划和果实的高效利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：从生长良好的‘灿烂’（‘Brightwell’）、‘乡铃’（‘Homebell’）、‘园蓝’（‘Gardenblue’）、‘昂丝萝’（‘Onslow’）和‘顶峰’（‘Climax’）5 个品种目标树上分别随机选取无病虫害、无机械损伤且完全成熟的蓝莓果实作为试验材料。所有品种蓝莓果实均于2020年6月下旬采于湖南省森林植物园天际蓝莓园，蓝莓采收后以125 g/盒分装于保鲜盒中，运回实验室后立即测定品质特征，其余果实于4℃下冷藏保存，备用。

试剂：乙醇、醋酸钠、福林酚试剂、Na2CO3、AlCl3、NaNO2、NaOH、HCl、KCl 均为分析纯，产自国药集团化学试剂有限公司；没食子酸、芦丁、1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2,2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）均为标准品，产自美国Sigma 公司；甲醇、乙酸均为色谱纯，产自美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

超声清洗机SB—25—12DT 宁波新芝生物科技股份有限公司；手持便捷式水果硬度计 FHT—15 广州兰泰仪器技术有限公司；迷你数显糖度计PAL—1日本ATAGO 公司 、数显酸度计pHS—25 上海虹益仪器仪表有限公司；恒温水浴锅XMTD—7000 北京市永光明医疗仪器有限公司；离心机 Centrifuge 5418 德国Eppendorf 公司；UV1200 紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器公司；1260 型高效液相色谱仪 美国Agilent 公司；Agile ZORBAX SB—C18 分析型色谱柱4.6 mm×250 mm，5 μm 美国Agilent 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取液制备

将蓝莓果实用研钵研成匀浆，取1 g 蓝莓匀浆与10 mL 酸化乙醇（乙醇∶水∶HCl，V∶V∶V=70∶29.9∶0.1）充分混合，超声提取30 min，然后在转速10 000 r/min，4 ℃下离心20 min，取上清液。提取操作重复3 次，合并上清液得到提取液，并记录体积。

1.3.2 果实品质指标测定

单果质量：随机选择40 颗果实，测量单果质量。

水分含量：采用直接干燥法，按照GB 5009.3—2016 的相关要求进行。

硬度和可溶固形物：参照文献[18]的方法直接测定。

总酸：采用酸度计直接测定。

固酸比：计算可溶固形物与总酸的比值。

1.3.3 抗氧化活性物质测定

蓝莓抗氧化活性物质的测定均使用酸化乙醇提取液进行测定。

总酚测定：以没食子酸为标准品采用福林酚法，参照Kim 等[19]的方法并加以调整后进行测定。没食子酸含量—吸光度的标准曲线为：Y=0.010 5X+0.006，R2=0.997 1。提取液适当稀释得待测液，待测液中总酚含量以没食子酸当量计，根据标准曲线计算待测液中没食子酸的浓度。蓝莓的总酚含量由式（1）计算得出。

式中：CF为待测液中总酚含量，mg/mL；DF为测试样稀释倍数；V为样液定容总体积，mL；m为试样质量，g。

总黄酮测定：以芦丁为标准品按照杜庆鑫等[20]的方法并加以调整后进行测定，芦丁含量—吸光度的标准曲线为：Y=0.012 4X-0.001 8，R2=0.999 2。提取液适当稀释得待测液，待测液中总黄酮含量以芦丁当量计，根据标准曲线计算待测液中芦丁的浓度。蓝莓的总黄酮含量计算公式如下。

式中：CT为待测液中总酚含量，mg/mL；DT为测试样稀释倍数；V为样液定容总体积，mL；m试样质量，g。

总花色苷测定：采用pH 示差法，参照文献[21]的方法并加以调整后进行测定。样液适量稀释得待测液，分别取1 mL 待测液于两支试管中，分别加入4 mL pH=1.0 的氯化钾缓冲液和pH=4.5的醋酸钠缓冲液，摇匀后常温避光静置50 min，分别测定两份试液的吸光度，波长选择510 nm 和700 nm。蓝莓总花色苷含量的计算如式（3）所示。

式中：A=（A510-A700）pH=1.0-（A510-A700）pH=4.5；M 为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分子量，449.2；DH为待测液稀释倍数；V为样液定容总体积，mL；ε为矢车菊素-3-O 葡萄糖苷的消光系数，26 900；L为光程，1 cm；m试样质量，g。

1.3.4 抗氧化能力测定

蓝莓抗氧化能力的测定均采用酸化乙醇提取液进行测定。

蓝莓果实提取液的DPPH 自由基清除能力：参照文献[22]的方法并加以调整。取0.5 mL 提取液与4.5 mL 0.7 mmol/L 的DPPH 自由基储备液充分混合，每隔3 min 于波长517 nm 处测定其混合液的吸光度AE。取0.5 mL 酸化乙醇与4.5 mL 0.7 mmol/L 的DPPH 自由基储备液反应并测定其吸光度A0。取0.5 mL 提取液与4.5 mL 去离子水充分混合，测定其吸光度AB。DPPH 自由基清除率由公（4）计算得出。

蓝莓果实提取液的ABTS 自由基清除能力：参照李志晓等[23]的方法并加以调整。取0.1 mL 提取液与2.9 mL 稀释后的ABTS 自由基测试液充分混合，每隔2 min 于波长734 nm 处测定其吸光度AE。取0.1 mL 酸化乙醇与2.9 mL 稀释后的ABTS自由基溶液反应并测定其吸光度A0。取0.1 mL 提取液与2.9 mL 乙醇充分混合均匀，测定其吸光度AB。ABTS 自由基清除率由公式5 计算得出。

1.3.5 多酚组成分析方法

提取物多酚种类分析方法：移取一定量的提取液，用3 倍体积的乙酸乙酯分别萃取3 次，合并上层液体并于45℃蒸干，用色谱级甲醇定容至2 mL，过0.45 μm 滤膜待测。选用儿茶酸、绿原酸、表儿茶素和阿魏酸为标准品，洗脱程序按照文献[24]的方法进行设置。4 种标准品的液相图谱如图1所示。

图1 4 种标准品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC spectrum of four standard substances

1.4 数据处理

采用Excel 2019 软件进行数据处理，采用SPSS 22.0 软件进行方差分析(ANOVA)，并使用Duncan 多范围检验以95%的置信区间表示结果差异显著，使用Pearson 相关性来进行参数之间的相关性分析，图片采用Origin 2018 软件绘制，所有数值均为3 次平行测定的算术平均值。

2 结果与分析

2.1 蓝莓果实品质指标

5 个品种蓝莓果实品质指标如表1所示，由表1 可知，不同品种蓝莓单果质量有较大差异，其中‘灿烂’单果质量最大，‘乡铃’和‘昂丝萝’单果质量最小。不同品种蓝莓果实的含水量和硬度也有一定的差异，‘顶峰’含水量最高，‘灿烂’和‘昂丝萝’次之，‘乡铃’和‘园蓝’含水量最少，由此可见‘顶峰’更适合加工为饮料；除‘园蓝’外，其他4 个品种的蓝莓果实硬度均在3以上，因此‘园蓝’果实耐储存性能较差。蓝莓果实的总酸和可溶固形物在很大程度上决定了蓝莓的口味，表1 的数据表明不同品种蓝莓总酸含量差异较大，可溶固形物含量差异较小，其中‘乡铃’总酸含量最高，‘灿烂’总酸含量最低，仅为‘乡铃’总酸含量的69.47%；5 个品种蓝莓果实可溶固形物含量最高的是‘园蓝’，‘昂丝萝’可溶固形物含量最低。5 个品种蓝莓果实固酸比差异极显著，‘灿烂’具有最高的固酸比，其次为‘园蓝’，‘昂丝萝’和‘顶峰’紧随其后，‘乡铃’固酸比仅为‘灿烂’的70.93%，因此推测‘灿烂’果实口味较甜，‘乡铃’果实口味偏酸。

表1 不同品种蓝莓果实品质指标†Table 1 Quality parameters of different blueberry cultivars

2.2 抗氧化活性物质

5 个品种蓝莓果实中抗氧化活性物质含量如图2所示。可以看出不同品种蓝莓果实中3 种抗氧化活性物质的含量均有较大差异，蓝莓果实总酚含量明显高于总黄酮和总花色苷含量，其中‘顶峰’总酚含量最高，达到4.63 mg/g，‘灿烂’总酚含量最低，仅为‘顶峰’总酚含量的61.12%。5 个品种蓝莓果实的总黄酮含量在0.61～0.97 mg/g，总黄酮含量最高的为‘昂丝萝’，其次为‘园蓝’（0.78 mg/g），‘乡铃’的总黄酮含量最低。‘顶峰’果实总花色苷含量最高（1.15 mg/g），其次为‘乡铃’，‘灿烂’的总花色苷含量最低，仅为‘顶峰’果实的54.78%。综上所述，5 个品种蓝莓果实的抗氧化活性物质含量有较大差异，‘顶峰’抗氧化活性物质含量明显高于其他4 个品种，‘灿烂’抗氧化活性物质含量最低。

图2 不同品种蓝莓抗氧化活性物质含量Fig.2 Contents of antioxidant substances of different blueberry cultivars

2.3 抗氧化能力分析

蓝莓果实抗氧化物质含量较高，具有较强的抗氧化能力。5 个品种蓝莓的抗氧化能力如图3所示，可以看出不同品种蓝莓果实的抗氧化能力存在较大差异。反应开始后各品种蓝莓果实提取液的DPPH 自由基清除速度有一定的差异，当反应时间为0～10 min 时，‘乡铃’提取液具有更快的DPPH 自由基清除速度，反应开始20 min 后，蓝莓果实提取液对DPPH 自由基的清除基本达到稳定状态，蓝莓果实提取液的DPPH 自由基清除率由高到低依次为：‘顶峰’＞‘乡铃’＞‘昂丝萝’＞‘园蓝’＞‘灿烂’，且‘灿烂’的DPPH 自由基清除率不足‘顶峰’的80%。当反应时间为0～5 min 时，‘昂丝萝’提取液的ABTS 自由基清除速度最快，反应开始10 min 后，蓝莓果实提取液与ABTS 自由基的作用基本达到平衡；‘顶峰’果实提取液对ABTS自由基清除效果最好，清除率高达50%；‘灿烂’和‘园蓝’对ABTS 自由基的清除效果较差。蓝莓果实抗氧化能力与其抗氧化物质的组成和含量有较大关系，因此需进一步对3 种抗氧化物质和抗氧化能力进行相关性分析。

图3 不同品种蓝莓抗氧化能力Fig.3 Antioxidant ability of different blueberry cultivars

蓝莓抗氧化物质与抗氧化能力相关性分析结果如表2所示，可以看出蓝莓果实提取液的DPPH和ABTS 自由基清除能力与总酚和总花色苷含量均呈极显著正相关，与总黄酮含量无显著相关性，而DPPH 自由基和ABTS 自由基作用原理类似，从而导致2种抗氧化指标均与总黄酮含量无显著相关性。

表2 抗氧化物质与抗氧化能力相关性分析†Table 2 Correlation coefficients of antioxidant substances and ability

2.4 多酚组成分析

现有的研究报道表明蓝莓中多酚的组成和含量受品种、产地等因素的影响较大，蓝莓中的多酚主要有没食子酸、儿茶酸、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、阿魏酸等[25-27]。根据本实验室条件，选用儿茶酸、绿原酸、表儿茶素和阿魏酸为标准品对5 个品种蓝莓果实中的多酚进行分析。

不同品种蓝莓果实多酚的组成如图4所示，由图4 可知蓝莓果实中多酚的组成复杂，除以上4种有标样的多酚外，蓝莓果实中还含有较多无标样的多酚，根据出峰数量可以推测蓝莓中多酚的种类至少在12 种以上。根据液相保留时间，以上4 种有标样的多酚均能在‘灿烂’中检出，但4 种多酚的响应值不高；‘乡铃’‘园蓝’和‘昂丝萝’中仅能检测出绿原酸和表儿茶素，且这两种多酚在图谱中拥有较高的响应值；‘顶峰’中响应值较高的是绿原酸、表儿茶素和阿魏酸。‘灿烂’中无标样多酚的种类繁多，是5 个品种中多酚组成最复杂的品种，‘乡铃’‘园蓝’‘昂丝萝’和‘顶峰’中无标样多酚的种类较少。

图4 蓝莓多酚HPLC 图谱Fig.4 HPLC spectrum of polyphenols in blueberry

蓝莓中各多酚的种类和含量如图5所示（图中仅标注了含量高于3%的多酚），5 个品种蓝莓中4 种有标样多酚的含量最高的是绿原酸，绿原酸在5 个品种蓝莓中均能检出，且含量明显高于其他多酚，为45.77%～93.54%，其次是表儿茶素，含量为4.22%～17.46%，儿茶酸和阿魏酸仅在‘灿烂’和‘顶峰’中检出，且含量较低，这说明蓝莓果实中儿茶酸和阿魏酸含量受蓝莓品种影响较大。‘灿烂’‘乡铃’‘园蓝’‘昂丝萝’和‘顶峰’中无标样多酚的含量分别为31.63%、7.23%、0.00%、8.50%和5.89%，由此可见蓝莓中多酚主要成分是绿原酸，其次是表儿茶素，这两种多酚含量占蓝莓总多酚含量的63.23%。

图5 蓝莓多酚种类及含量Fig.5 Composition and contents of polyphenols in blueberry

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究对兔眼系列5 个不同品种蓝莓果实的品质指标、抗氧化物质含量、抗氧化能力以及多酚组成进行了比较，结果表明蓝莓果实的品质指标和抗氧化物质含量与品种有很大关系。

不同品种蓝莓单果质量有较大差异，其中‘灿烂’的单果质量最大，‘乡铃’的单果质量最小，5 个品种蓝莓果实从大到小排序为：‘灿烂’＞‘顶峰’＞‘园蓝’＞‘昂丝萝’=‘乡铃’；不同蓝莓品种果实含水量存在一定的差异，‘顶峰’的含水量最高；不同品种蓝莓果实硬度存在显著差异，‘乡铃’硬度最高，‘园蓝’硬度最低；5 个品种中，‘园蓝’的可溶固形物含量最高，其次为‘顶峰’和‘灿烂’，‘昂丝萝’的可溶固形物含量最低；不同品种蓝莓总酸含量差异较大，‘乡铃’的总算含量最高；‘灿烂’的总酸含量最低，不同品种蓝莓果实固酸比存在显著差异，从高到低依次为：‘灿烂’＞‘园蓝’＞‘昂丝萝’=‘顶峰’＞‘乡铃’。

5 个品种蓝莓抗氧化活性物质含量和抗氧化能力存在显著差异，其中‘顶峰’的总酚含量最高，‘灿烂’和‘园蓝’总酚含量最低；5 个品种蓝莓果实总黄酮含量从高到低依次为：‘昂丝萝’＞‘园蓝’＞‘顶峰’=‘灿烂’＞‘乡铃’；总花色苷含量最高的是‘顶峰’，其次为‘乡铃’，‘灿烂’的总花色苷含量最低。‘顶峰’具有最佳的DPPH 和ABTS 自由基清除效果，‘灿烂’和‘园蓝’的自由基清除效果较差。蓝莓果实对DPPH和ABTS 自由基清除能力与其总酚和总花色苷含量均呈极显著正相关关系。

HPLC 分析结果表明蓝莓中至少含有12 种多酚，其中绿原酸和表儿茶素是含量最高的2种多酚。蓝莓果实中多酚组成的复杂程度与品种有较大关系，本研究中5 个品种蓝莓果实中多酚组成的复杂程度为：‘灿烂’＞‘顶峰’＞‘乡铃’=‘昂丝萝’＞‘园蓝’。

不同品种的蓝莓果实可根据其理化特征进行高值化利用。‘灿烂’和‘园蓝’果大味甜，3 种抗氧化物质含量和自由基清除率明显低于其他3个品种，因此这2 个品种更适合鲜食，而‘灿烂’硬度稍高，较耐储存，而‘园蓝’硬度较低，不适合长途运输。‘乡铃’和‘昂丝萝’固酸比适中，含水量不高，硬度较高，储存时间较长，抗氧化物质含量和抗氧化能力在5 个品种中均为中等，因此既适合鲜食也适合果干类食品加工。‘顶峰’果实的可溶固形物和含水量较高，果实中3 种抗氧化物质含量较高，且抗氧化能力明显强于另外4个品种，因此‘顶峰’适合果汁和功能食品加工。

3.2 讨论

在本研究选用的5个蓝莓品种中，‘灿烂’和‘园蓝’果实更加适合鲜食，可在长株潭城市群和成熟的旅游区等生活水平高、蓝莓鲜食需求量大的区域适量加大推广种植面积。‘乡铃’和‘昂丝萝’的果实既适合鲜食也可用于果干类食品加工，‘顶峰’果实除了用于果汁和果酒加工外还可以用来开发功能食品，这与前人对不同品种蓝莓加工特性的研究结论是类似的[28-31]。在蓝莓鲜食需求量较少、以深加工为主的区域，适量种植‘灿烂’和‘园蓝’的同时可加大推广‘乡铃’‘昂丝萝’和‘顶峰’种植面积。

不同品种蓝莓果实对DPPH 和ABTS 自由基的清除速度和清除率均存在较大差异，5 个品种蓝莓果实的抗氧化能力与总酚和总花色苷含量呈极显著正相关，而与总黄酮含量无显著相关性。羿月同等[32]和刘晓娟等[33]研究表明这可能是由于蓝莓果实中各类抗氧化物质之间存在协同作用，各类抗氧化物质含量不同导致协同效果存在差异。

HPLC 分析结果表明不同品种蓝莓果实多酚组成存在一定的差异。‘灿烂’果实中多酚组成最复杂，除了4 种有标样多酚外还含有多种无标样多酚。一般来说多酚的组成越复杂抗氧化能力越强[34-35]，但在本研究中‘灿烂’并没有表现出优越的抗氧化能力，这可能是由于‘灿烂’果实中各种多酚的含量明显低于其他品种导致的。‘乡铃’‘昂丝萝’和‘顶峰’果实的抗氧化能力明显强于‘园蓝’，这可能是因为与另外3 个品种相比，‘园蓝’果实中多酚的组成比较单一，仅含绿原酸和表儿茶素，不同多酚之间协同增效的效果较差导致抗氧化能力较弱[36]。总体来看蓝莓果实中含量较高的多酚分别是绿原酸和表儿茶素，其中绿原酸的含量占所有多酚含量的45.77%以上，表儿茶素的含量占4.22%以上，这与前人的研究结果是一致的[37-38]。

蓝莓作为一种备受广大消费者喜爱的第3 代水果，本研究仅对兔眼系列5 个品种蓝莓果实的品质特征、抗氧化能力和多酚组成进行了初步比较分析，对不同系列（兔眼、南高丛和北高丛系列）不同品种的蓝莓果实的相关指标的综合比较分析和蓝莓高值化利用仍有待进一步研究探讨。此外，本研究仅用4 种标准品对5 个品种蓝莓果实中的多酚组成进行了比较，并未对液相色谱图中的未知峰进行物质鉴定。因此，下一步还需对未知多酚进行鉴定，对不同品种蓝莓果实中其他抗氧化物质进行定性和定量分析，更深层次地探究蓝莓中抗氧化物质与抗氧化能力之间关系，为蓝莓资源的高值化利用提供更强的理论依据。