PGPR对莠去津污染土壤中结缕草生长及生理的影响

郑培峰，姜小蕾，翟彦霖，郭绍霞，李 伟

（1吉林农业大学农学院，长春 130118；2吉林省农业科学院资源与环境研究所/玉米国家工程实验室，长春 130033；3青岛农业大学园林与林学院，山东青岛 266109）

0 引言

近年来，随着农业生产中农药的过度使用，农田土壤污染日益严重。长期喷施农药会在田间形成残留，将直接影响农业绿色生产和人类安全。除草剂是农药的常见类型之一，作为防治田间杂草的重要手段，在农业生产上得到广泛应用；有研究表明某些类型的除草剂具有高残留效应，会导致土壤环境受到威胁，因此，减小除草剂对植物的影响，消除除草剂残留污染一直受到学者广泛关注[1]。

莠去津是世界上使用最广泛的除草剂之一，对杂草防治具有十分好的效果，在国内也得到广泛使用，并且其使用量逐年递增[2]。莠去津的作用机理主要是通过影响植物三磷酸腺苷和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产生进而干扰光系统II，最终降低CO2固定效率，同时也限制叶绿叶绿体电子传递系统导致超氧离子自由基快速积累，造成细胞膜损伤，诱发植物死亡[3]。作为一种优秀的除草剂类型，其缺点也较为显著，相关研究表明，莠去津在清除杂草后，会在土壤中长期残留，对后续植物的生长形成威胁[4]。此外，莠去津会对人体产生严重危害，影响人体内分泌系统、免疫系统、生殖系统等各个系统，产生各种疾病，诱发癌症[5]。因此，如何降低莠去津残留，恢复土壤健康成为了农业生产领域亟需解决的难题。

生物修复技术被认为是目前最具发展潜力的土壤修复技术，利用植物-微生物协同修复的办法，充分发挥植物与微生物的优势，提高对污染土壤的修复作用[6]。研究已发现，覆盖作物能够修复土壤结构，改善土壤理化性质，降低农药残留。结缕草作为众多覆盖植物种类中的一种，具有重要利用价值。但是有关结缕草修复农药残留土壤的机理尚未明确，关键在于结缕草受除草剂莠去津威胁较大，难以存活。而位于植物根系的根际促生菌可能会对结缕草的生长起到促进作用。

存在于植物根系周围的根际促生菌是一类能够为植物提供帮助并能够定殖于植物根际的细菌[7]。PGPR对植物生长具有非常好的效果，适量的接种后可提高植物对土壤中的营养成分的吸收效率、促进植物生长[8]，降低植物中的葡萄糖感应和脱落酸水平，增强植物的光合作用[9]，提高植物有机物积累量[10]。在对土壤结构的改善方面，PGPR同样具有一定的效果。某些PGPR菌剂，如解磷解钾菌，它可以分泌有机酸，分解土壤中难溶性矿物质，增加土壤酶活，促进土壤中磷、钾及一些难溶性矿质元素的释放、改善土壤营养状况以及土壤微生态结构等[11]。有研究表明，即使在逆境环境下，使用PGPR等土壤微生物，仍可以增强植物生命力，提高植物抗逆能力[11]。因此，运用根际微生物提高结缕草生命力以应对莠去津毒害是非常值得研究的问题。本研究希望通过探究结缕草接种PGPR后对不同莠去津浓度的生理生化反应，确定出接菌后结缕草可承受莠去津毒害的最大范围，为结缕草消除土壤莠去津残留机理研究提供前期技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为结缕草（购自北京百斯特草业有限公司），供试PGPR菌为荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens,Ps2-6)，由青岛农业大学菌根生物技术研究所分离、鉴定和保存，采用牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐培养基培养菌种备用；供试药剂为中保27%烟·硝·莠去津可分散油悬浮剂（购自山东金农华药业有限公司）；栽培基质为经过200目筛后，由121℃高温高压蒸汽灭菌2 h后的原土，土壤pH 6.26，有机质含量5.3 g/kg，全氮含量1.2 g/kg，全磷含量0.4 g/kg，全钾含量5.1 g/kg，碱解氮含量56.1 g/kg，有效磷含量56.1 mg/kg，速效钾含量50.2 g/kg。

1.2 试验设计

试验于2018年8—10月在青岛农业大学温室大棚内进行，采用盆栽试验，设置4个莠去津浓度0、3、15、75 mg/kg，分别接种PGPR，以不接种为对照(CK)，共8个处理，随机排列，每个处理重复5次。试验前，将事先配置好的莠去津混合液按对应处理浓度均匀混入土壤中，使之保持0、3、15、75 mg/kg莠去津浓度，7天后播种结缕草，待结缕草出苗两周后，各处理分别接种30 mL PGPR菌液，分3次注入，每次10 mL，间隔3天，对照组则注入等量灭菌接种物。结缕草种子用10% H2O2浸泡消毒10 min后置于滤纸晾干。每盆称取1.0 g的结缕草种子均匀的播种至上口径16 cm，下口径12 cm，高20 cm塑料盆内（75%酒精擦拭消毒，每盆4 kg基质），出苗前，每周3～4次水，均匀且充足，在培养期间注意温度、光照和通气状况，种子萌发后，每2天浇1次水，保证结缕草的生长需求的前提下严禁积水。定期观察并记录其生长情况，幼苗生长60天后，测量结缕草相关指标。

1.3 指标测定

1.3.1 防御性酶活性及相关物质含量测定 过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚氧化法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定；游离脯氨酸(pro)含量采用酸性茚三酮比色法测定；丙二醛(MDA)含量采用比色法测定；相对电导率采用电解质渗透法测定；上述指标均采用王学奎[12]描述方法测定。

1.3.2 结缕草光合参数及叶绿素荧光参数测定 选择晴朗少云的天气，在9:30—11:30，使用便携式光合仪CIRAS-3测定叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)等参数。使用Pocket PEA荧光仪测定叶片叶绿素荧光参数，叶片暗适应20 min后，测定暗适应后光系统II(PSII)的最大光化学效率(Fv/Fm)和PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)。

1.3.3 生长指标及叶绿素含量测定 株高：自茎基部至顶芽分生处长度；鲜重：将地上部植株和地下部根系分开并清洗干净，分别用分析天平测量；干重：将测定完鲜重的植株和根系分别装入档案袋，将烘箱调到105℃杀青30 min，再调到80℃烘至恒重，用分析天平测量；叶绿素 a(Chl a)、b(Chl b)、总叶绿素 Chl(a+b)、叶绿素a/b(Chl a/b)和类胡萝卜素(Car)含量采用乙醇丙酮混合液法测定。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 25.0软件对数据进行差异显著性检测。

2 结果与分析

2.1 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草生长的影响

同一接菌处理下，随莠去津浓度的增加，结缕草株高、地上部鲜重、干重，地下部鲜重、干重均呈现降低趋势，表明莠去津对结缕草生长造成显著影响，同一莠去津浓度，接种PGPR显著提高株高，中、低莠去津浓度，接种处理显著提高地上部鲜重、干重，高莠去津浓度，接种处理出现下降；3 mg/kg下，与CK相比，接种PGPR的结缕草株高、地上部鲜重、干重分别增加71.43%、47.69%和78.13%（表1），综上，接种PGPR可以显著提高结缕草生物量的积累。

表1 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草生长的影响

2.2 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草光合特征的影响

2.2.1 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草色素含量及荧光参数的影响 同一接种处理下，随莠去津浓度增加，结缕草Chl a、Chl b含量及Chl(a+b)含量基本呈现先增加后降低的趋势，Chl a/b、Fv/Fm和Fv/Fo呈现下降趋势，Car变化不显著，表明莠去津对叶绿素含量及荧光参数影响显著。同一莠去津浓度下，接种PGPR处理，在低浓度均显著增加结缕草Chl a、Chl b、Chl(a+b)、Car含量和Fv/Fm值和Fv/Fo值，中浓度仅提高Chl a、Chl b、Chl(a+b)和Car含量，但高浓度下各指标均降低；在3 mg/kg莠去津水平下，与CK相比，接种PGPR处理的结缕草叶片Chl a、Chl b、Chl(a+b)、Car含量、Fv/Fm值和Fv/Fo值分别增加45.8%、39.5%、44.7%、22.2%、9.9%和41.04%；15 mg/kg莠去津水平下接种处理的结缕草叶片Chl a、Chl b、Chl(a+b)和Car含量分别增加82.2%、85.0%、82.3%、60.0%（表2，图1）。由以上结果可知，接种PGPR在莠去津低浓度时，可促进结缕草光合色素合成，提高叶片色素含量，增加Fv/Fm和Fv/Fo，中浓度下，只提高叶片色素含量，对Fv/Fm和Fv/Fo作用效果不显著，而高浓度，接菌处理的结缕草色素含量却出现降低，Fv/Fm和Fv/Fo与中浓度表现相一致。说明仅在莠去津低浓度时，接菌处理可同时提高结缕草叶片色素含量及Fv/Fm和Fv/Fo值。

图1 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草叶绿素荧光参数的影响

表2 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草色素含量的影响

2.2.2 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草光合参数的影响 同一接菌处理下，随莠去津浓度的增加，结缕草叶片Pn呈现下降趋势，Ci呈现上升趋势，对照处理中，随莠去津浓度的增加，结缕草叶片Tr、Gs呈现下降趋势，接菌处理Tr、Gs变化不显著；中，低浓度莠去津处理，接种PGPR处理增大Pn，降低Gs、Tr、Ci，高浓度莠去津处理则相反。3 mg/kg下，与CK相比，接种PGPR的结缕草叶片Pn增加184.83%，Tr降低9.6%，Gs和Ci作用不显著，15、75 mg/kg下，与CK相比，接种PGPR的结缕草叶片Pn、Gs、Tr、Ci变化不显著（图2）。可见，接种PGPR可以提高结缕草叶片Pn，但限于莠去津低浓度范围，对于中、高浓度表现效果不显著。

图2 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草Pn、Tr、Gs和Ci的影响

2.3 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草抗逆生理指标的影响

2.3.1 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草MDA含量和相对电导率的影响 同一接菌处理下，随莠去津浓度的增加，结缕草叶片和根系MDA含量和相对电导率基本呈现升高趋势，中，低浓度莠去津处理，接种PGPR显著降低MDA含量和相对电导率，高浓度莠去津处理效果相反。3 mg/kg下，与CK相比，接种PGPR的结缕草叶片和根系MDA含量和相对电导率分别降低27.4%和2%、13.4%和36.0%，15、75 mg/kg变化不显著（表3）综上，接种PGPR可显著降低结缕草MDA含量和相对电导率。

表3 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草MDA含量和相对电导率的影响

2.3.2 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草部分防御性酶和渗透调节物质含量的影响 同一接菌处理下，随莠去津浓度的增加，结缕草叶片POD活性、可溶性蛋白含量及脯氨酸含量呈现先升高后下降的趋势；中低浓度莠去津处理，接种PGPR显著提高POD活性、增加可溶性蛋白和脯氨酸含量，高浓度莠去津处理，接种PGPR显著增加脯氨酸含量。3 mg/kg下，与CK相比，接种Ps2-6的结缕草叶片POD活性分别增强196.7%，可溶性蛋白和脯氨酸含量分别增加93.9%和137.1%，15 mg/kg接种PGPR的结缕草叶片可溶性蛋白和脯氨酸含量分别增加347.3%和169.6%，75 mg/kg变化不显著（表4）。

表4 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草叶片部分防御性酶和渗透调节物质含量的影响

2.4 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草生长及生理特性的相关性分析

方差分析结果如表5所示，结果表明，PGPR、莠去津及两者交互作用均对结缕草株高、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重及地下部干重影响极显著(P＜0.01)。PGPR对结缕草叶片光合特征指标中Chl a、Chl b、Chl(a+b)、Fv/Fo、Pn和Tr影响极显著(P＜0.01)，对Tr影响显著(P＜0.05)；莠去津对结缕草叶片Chl a、Fv/Fm、Fv/Fo、Pn、Tr、Gs和Ci影响极显著(P＜0.01)，对Chl(a+b)影响显著(P＜0.05)，PGPR与莠去津交互作用对结缕草叶片Fv/Fo、Pn、Tr和Gs影响极显著(P＜0.01)，对 Chl a、Chl(a+b)、Car影响显著(P＜0.05)。PGPR对结缕草叶片抗逆生理指标中脯氨酸含量影响极显著(P＜0.01)；莠去津对结缕草叶片抗逆生理指标中叶片相对电导率和根系相对电导率影响极显著(P＜0.01)，对叶片MDA含量和根系MDA含量影响显著(P＜0.05)；二者交互作用对对结缕草叶片抗逆生理指标中叶片相对电导率和根系相对电导率影响显著(P＜0.05)。

表5 PGPR对莠去津污染土壤下结缕草生长及生理特性的相关性分析

3 讨论

随着农药大面积施用，莠去津作为重要田间除草剂，带来的土壤污染范围也日益增加，莠去津胁迫下，植物的生长受到抑制，株高等生物量显著降低[13]，有研究发现接种PGPR可修复受污染的土壤，降低土壤残留重金属离子，改善土壤理化性质，提高植物生命力[14-15]，本试验发现，接种PGPR后，与对照相比，结缕草株高、地上部和地下部生物量具有不同程度的增加，这表明接种PGPR对结缕草生长具有积极影响。杜寒春等[16]的研究也已证实，PGPR可在植物根际定殖，依附于植物根表面或生活在植物组织内，促进植物相关激素产生，加速植物生长。

作为植物光合作用的关键色素，叶绿素承担着吸收光量子固定光化学能的作用，一直是逆境研究的重点，研究表明，植物在除草剂的胁迫下，色素含量随浓度的增加呈现显著下降趋势，多数植物叶片叶绿素合成速率降低，分解速率加快，从而导致植物出现黄化萎蔫症状[17]。张敏等[18]研究发现，接种PGPR可缓解胁迫带来的不良影响，显著提高植物色素含量。本试验结果表明，随着莠去津浓度升高，结缕草Chla/b逐渐降低，Chla和Chlb含量同步降低，说明结缕草受莠去津胁迫后，减缓了Chlb的分解速率，降低Chla/b，增强对弱光的利用效率。张倩等[19]研究发现植物对除草剂具有一定的耐受性，低浓度下，植物受到影响较小，而高浓度下植物生长则受到抑制。本试验中，结缕草在低浓度莠去津胁迫下，叶绿素含量升高，而高浓度下则降低，与之结果相似，这可能是由于植物在低浓度受到莠去津的刺激，加快叶绿素合成导致，而高浓度下，植物自身生理代谢紊乱，叶绿素合成途径受到阻碍，酶活性比例失调，或叶绿素快速分解，进而使结缕草叶绿素含量降低，李文彬等[20]在研究菲和芘胁迫下AMF和PGPR对高羊茅生理生态的响应中也得出相似的结论。图2数据显示，当叶绿素含量降低后，会进一步阻碍光合色素和光合电子传递，导致结缕草叶片气孔阻力增加，CO2进入气孔受阻，但可能是由于莠去津影响三磷酸腺苷和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产生，干扰PSII降低CO2的固定效率，最终导致Ci上升，叶片Pn和Tr下降，光合作用降低，影响植物生长。接种PGPR可提高结缕草叶绿素含量，缓解莠去津带来的危害，增强光合能力和生物量，这可能与PGPR增强植物根系对矿质元素的吸收和转化能力有关[21]，其他相关原因需进一步深入研究。

叶绿素荧光参数体现在光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散和分配等方面[22]，Fv/Fm和Fv/Fo是反应植物光抑制的重要指标。试验结果表明，莠去津胁迫下，不同处理间结缕草Fv/Fm和Fv/Fo均降低，出现光抑制现象，低浓度莠去津胁迫下，接种PGPR处理Fv/Fm值和Fv/Fo值较高，Fv/Fo值显著高于对照组，Fv/Fm与对照相比无显著性差异，高浓度下Fv/Fm值和Fv/Fo值与对照相比均无显著差异。这表明接种PGPR处理可增强植物叶片在光合过程中的传递，但可能由于莠去津胁迫，影响三磷酸腺苷和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产生，进而干扰PSII，导致接种处理作用并不显著。

相关研究表明，植物遭受胁迫后，体内活性氧自由基数量发生变化，导致膜脂过氧化加剧并伴随着膜脂透性增大，MDA含量升高，植物细胞膜系统损伤[23]；并且由于植物细胞膜透性变大导致细胞内电解质外渗，电导率显著增大[24]。本试验结果与之相同，低浓度莠去津胁迫下，接种PGPR可降低结缕草叶片和根部的MDA含量及相对电导率值，但中、高浓度下，相较于不接菌处理没有显著差异，表明接种PGPR在一定程度上能缓解莠去津对结缕草叶片细胞过氧化程度，提高结缕草的抗毒性。但随着莠去津浓度增加，接菌对结缕草抗毒效果逐渐降低，表明结缕草对莠去津的抗性存在一定的耐受阈值，马兵兵等[25]的研究结论也表明植物对于莠去津胁迫存在耐受范围。接种PGPR可扩大结缕草的耐受阈值，这可能是由于接种PGPR后，菌群进行趋化运动，在根表面形成生物膜，增强了植物抗氧化能力，具体相关原因还需进一步验证。

当外界环境发生变化时，植物生长发育受到刺激，产生较多的含氧自由基、过氧化物等物质，引起膜脂过氧化，致使膜受到损伤，植物通常会自主调节细胞渗透势[26]，增加体内POD等防御性酶含量以减轻胁迫带来的伤害[27]。研究表明，植物遭受胁迫时，脯氨酸和可溶性蛋白含量显著增加[28]，植物通过渗透调节物质的积累来降低细胞的渗透势，从而保护细胞内酶活性，来维持细胞的正常功能。本试验发现不同浓度莠去津胁迫下，接种PGPR的结缕草脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均高于对照，以3 mg/kg浓度下作用最为显著，并且在此浓度下，接种PGPR的结缕草POD含量显著高于对照，表明接种PGPR可提高莠去津胁迫下结缕草渗透调节能力，提高防御性酶含量，缓解毒害造成的损伤。

研究结果初步明确了接种PGPR可提高结缕草的生命力和抗逆性，在一定程度上缓解莠去津带来的毒害，但主要作用在低浓度范围，中、高浓度范围效果较差。此外本试验是基于室内盆栽研究，考虑因数较为单一，针对于大规模田间应用尚缺乏系统研究。为进一步明确PGPR对促进植物生长的具体机理，探明实际田间环境中PGPR的应用价值，在未来的研究工作中将会针对结缕草在莠去津胁迫下的调控基因表达开展系统研究，于田间开展规模性试验，为PGPR在农药残留地应用提供理论依据。

4 结论

试验初步确定接种PGPR有效缓解莠去津对植物伤害的浓度范围在0～3 mg/kg，对高浓度莠去津毒害无显著效果。通过接种PGPR，提高了结缕草叶片色素含量和抗氧化能力，增强叶片光合效能，减弱莠去津胁迫导致的膜脂过氧化损伤，促进植物健康生长。