新型冠状病毒核酸检测技术研究进展*

杨涵荞，王少峡

(天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617)

2019年12月底，由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的肺炎——新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)，是近百年来传播速度最快、感染范围最广、防控难度最大的全球性重大突发公共卫生事件。截止2021年5月30日，全球129个国家和地区累计确诊病例1.69亿，其中死亡病例大约为353万[1]。为有效控制病毒的传播，检测识别和隔离感染者尤为重要。本文旨在对新型冠状病毒的最新核酸检测技术做一综述，为临床诊断提供参考。

1 SARS-CoV-2的基因组特征

通过二代测序(next-generation sequencing，NGS)对病毒的完整序列和基因组表征进行分析，表明SARS-CoV-2是一种包膜的正向单链RNA(ssRNA)病毒。对该序列的系统进化分析表明，该序列属于冠状病毒属的冠状病毒科(Coronaviridae)[2]，与2003年发现的SARS病毒(SARS-CoV)具有79 %的基因组序列同一性[3]，与中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有50 %的基因组序列同一性[4]，且该序列与目前已知的感染人类的两种蝙蝠衍生的SARS样冠状病毒株(bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21)序列的相似性高达87.5 %[2]。SARS-CoV-2的基因组序列大小约为29.8 kb，具有14个编码27种蛋白质的开放阅读框(Open reading frame，ORF)[5]。位于基因组5'端的Orf1ab基因和Orf1a基因分别编码pp1ab蛋白和pp1a蛋白。它们总共包含15个非结构蛋白(non-structural proteins，NSPs)，包括NSP1至NSP10和NSP12至NSP16。基因组的3'末端可编码四个结构蛋白：包膜(E)，核衣壳(N)，膜(M)和刺突(S)蛋白，以及八个辅助蛋白(3a，3b，p6、7a，7b，8b，9b和orf14)[6]。其中，N蛋白保留病毒的RNA基因组，而S、E和M蛋白共同形成病毒包膜[7]。尽管在氨基酸水平上，SARS-CoV-2与SARS-CoV非常相似，但二者依然存在着差异。例如，SARS-CoV中存在的8a蛋白，在SARS-CoV-2中并不存在;8b蛋白和3a蛋白的氨基酸个数在两者之间存在差异等[6]。然而这些差异如何影响SARS-CoV-2的功能和发病机制还需要进一步的研究。

2 逆转录-聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)具有极高的灵敏度和特异性，是目前检测SARS-CoV-2的首选方法，也是使用最广泛的方法[8]。其基本原理是在一对引物(上游引物和下游引物)、逆转录酶、具有耐热性的Taq DNA聚合酶及脱氧核苷三磷酸的作用下，通过特殊的温度改变进行变性、退火和延伸，将病毒RNA的基因序列特异性放大扩增的过程。

编码SARS-CoV-2的N、E和S蛋白的基因，以及开放阅读框1ab(Orf1ab)和位于Orf1ab中的RNA依赖地RNA聚合酶(RdRp)基因，均可用RT-PCR进行特异性扩增检测[9]。由于在所有的冠状病毒中，E基因高度保守，N基因可能会与其他冠状病毒发生交叉反应，RdRp基因和S基因可用于区分与SARS-CoV-2有高度同源性的病毒，因此不同靶标的选择可能会影响RT-PCR的特异性[10]。为避免其他地方性冠状病毒的潜在交叉反应以及SARS-CoV-2的潜在遗传漂移，测定中应至少包括两个分子靶标[11]。目前，不同国家和地区已将多种此类分子靶标用于实时RT-PCR的检测分析中。

美国疾病预防控制中心在N基因上选择了N1、N2两个靶标。在常规RT-PCR时，N1、N2基因必须显示双阳性，否则不考虑阳性结果。只有对扩增子进行深度分析时，才可选用单个基因进行阳性确认。Charité方案使用E基因作为筛选测定，然后使用RdRp基因进行确认性检测[12]。有研究表明，N基因检测的灵敏度略低于E Sarbeco和RdRp基因。美国CDC所选用的N1和N2引物对的检测限(LOD)为1 copies/L，而E Sarbeco和RdRp基因的LOD分别为5.2和3.8 copies/L。其主要原因是美国CDC的nCoV-N2引物组易于背景扩增，从而削弱了在低病毒浓度下区分真阳性和阴性结果的能力[13]。巴斯德研究所的实验方案是使用IP2和IP4基因靶作为一线筛选工具，确认性测试则利用E基因靶。IP2和IP4基因单独用于检测时，每个反应可检测到约100 copies/L的RNA基因组当量，检测概率为95 %。当用其进行多重测定时只能获得较低的10 copies/L的基因组当量[12]。香港大学一项研究中利用了Orf1b和N基因作为靶标，扩增子大小和扩增效率分别为132 bp、99.6 %和110 bp、95.4 %,并且在对阳性临床样品的检测中发现，使用N基因作为靶标的灵敏度是使用Orf1b基因时的10倍左右[14]。经比较研究表明，来自Charité方案的引物E Sarbeco和来自香港大学研究方案的Orf1b-nsp 14最为敏感，在75 %的检测频率下，LOD为10 copies/L[13]。目前我国国家卫健委推荐使用SARS-CoV-2的三个特异性区域(Orf1ab基因、N基因、E基因)作为RT-PCR的扩增靶标。临床上主要使用的靶标为单靶标(Orf1ab)、双靶标(Orf1ab和N，Orf1ab和E)以及三靶标(Orf1ab，N，E)三种类型[15]。其中因具有较好的扩增效率和特异性，以Orf1ab基因和N基因的双基因靶标为最常用，且须显示双阳性才考虑阳性结果[15-16]。虽然目前依然无迹象说明所使用的任何一个序列区在临床诊断上具有独特的优势，但由于病毒的高度变异，为了减轻病毒遗传漂移的影响，研究人员在序列区的选择上只能遵循“既保守又特异”的原则，根据需要选择不同或多个基因作为靶标进行检测[11]。

3 其他新型SARS-CoV-2核酸检测技术

3.1环介导的等温扩增 环介导的等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年发明的等温DNA扩增技术，整个过程均在恒温下进行，有效地规避了常规PCR对于温度的特殊要求，因此目前正逐渐代替PCR被广泛应用于各种传染病的核酸检测，包括COVID-19[17]。此方法依靠一对内部引物(FIP与BIP)、一对外部引物(F3与B3)、6个靶基因特定序列(F1c、F2c、F3c、B1c、B2c、B3c)和具有高链置换活性的DNA聚合酶进行的在65C恒温状态下的自动循环链置换DNA合成，分为起始物合成和循环扩增两个阶段[18]。启动扩增从内部引物FIP结合靶基因F2c开始。链置换型DNA聚合酶将该引物延伸形成互补链。接着外部引物F3结合F3c，通过链置换型DNA聚合酶的作用将之前合成的DNA置换下来，并开始新的DNA延伸，与模板DNA形成双链结构[17,19]。被替换下来的引物端因其有反向互补序列而形成自杂交的环状结构。引物延伸和链置换会交替发生在靶DNA序列的两端，因此形成短哑铃状的DNA扩增[17]。新合成的DNA会形成多联体，并和扩增副产物大量重复交替产生，数量级可达109[18]。

目前，额外加入RNA逆转录酶的LAMP测定试剂(Reverse Transcription LAMP，RT-LAMP)，正广泛应用于COVID-19的诊断中[20]。研究表明，新冠病毒RNA的各种特异性靶标基因均可被LAMP成功检测，在30 min之内可获得的LOD为500 copies/mL，灵敏度比常规PCR高约100倍[21-22]。与PCR相比，RT-LAMP仅在单个反应管中加热样品和试剂即可在低配置资源下完成检测，且检测速度为RT-PCR的2倍左右，具有高灵敏性、高效快速、高特异性和操作便捷的特点[20,22]。

3.2DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR) 成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)由相同的重复DNA序列组成，由高度可变的序列隔开，与CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)组成CRISPR-Cas系统，作为适应性抗病毒免疫系统存在于大多数细菌与古细菌中[23]。近年来，研究人员将CRISPR-Cas系统的靶向切割特性运用到了核酸检测技术当中。与CRISPR结合的多种Cas酶，包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14，其中以CRISPR-Cas12系统和CRISPR-Cas13系统在核酸检测领域的应用最为广泛[24]。因其高效、精准、可视化的特点，DETECTR、SHERLOCK等多种基于CRISPR-Cas系统而开发的检测技术，均作为新型技术应用于SARS-CoV-2的分子诊断中。

DETECTR基于CRISPR-Cas12系统，通过激活Cas12a酶(ssDNase)，使crRNA-Cas12a复合物与靶DNA结合并诱导与荧光报告分子偶联的ssDNA的非特异性切割，从而释放荧光信号,这种荧光信号可被做成侧向流层析纸条，实现对病毒DNA检测的可视化[25]。研究表明，DETECTR利用的是编码SARS-CoV-2的N基因和E基因作为靶标进行检测，并不与其他冠状病毒发生交叉反应，检测时间在30～40 min，LOD值为10 copies/L，当有一个基因显示阳性时则可推断阳性结果。与RT-PCR相比，DETECTR对呼吸道拭子标本中SARS-CoV-2检测的灵敏度为90 %，特异性为100 %，且在对78例COVID-19感染者进行的临床测试中显示，阳性预测值和阴性预测值分别为95 %和100 %[24]。

3.3SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter) SHERLOCK也是基于CRISPR-Cas13系统，整合了等温重组酶聚合酶扩增(RPA)或具有Cas13 a核酸酶活性的逆转录RPA(RT-RPA)。crRNA-Cas13 a复合物可特异性结合并切割偶联至荧光报告基因的靶RNA以及非靶RNA，从而产生荧光信号[25]。该技术结合了多种Cas酶，如Cas13、Cas12a和Csm6，以便同时检测多种核酸，达到快速简便的效果。SHERLOCK具有高灵敏度，可区分仅有一个碱基对不同的靶标[24-25]。

在SARS-CoV-2的检测中，研究人员通过RPA对编码SARS-CoV-2的Orf1ab基因和S基因进行扩增，能够在10～100 copies/L的范围内检测到SARS-CoV-2的存在，检测时间大约为60 min。与RT-PCR相比，SHERLOCK的灵敏度和特异性分别为97 %、100 %[24]。与此同时，研究人员还开发了一种基于SHERLOCK的即时诊断(point-of-testing，POCT),该方法可将等温扩增和Cas酶检测靶RNA的步骤合并在同一个试管中进行，被命名为SHERLOCK test in a Pot(STOPCovid)。其灵敏度与RT-PCR相当，每次反应可检测100 copies/L的病毒基因组当量，且同样可用侧向流层析法观察并在70 min内得出结果。若用荧光检测读取信号，仅需要40 min。STOPCovid适用于1 h内的即时诊断，极大地有利于COVID-19的追踪隔离工作，并对资源匮乏的国家和地区的COVID-19诊断具有重大意义[26]。

3.4双功能等离子体生物传感器(Dual-Functional Plasmonic Photothermal Biosensors) 据新近的研究报道[27]，研究人员还开发了由等离子体光热(plasmonic photothermal，PPT)效应与局部表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance，LSPR)传感转导相结合的双功能等离子体生物传感器，该技术是利用金纳米粒子(AuNIs)产生局部PPT热并转导核酸杂交，结合LSPR系统检测PPT热所引起的周围环境折射率变化，将SARS-CoV-2 RNA和固定在AuNIs上与其互补的DNA探针进行核酸杂交，来对病毒RNA特定序列进行检测，具有高灵敏度，特异性，快速准确的特点。其选用的是SARS-CoV-2 RdRp和Orf1ab基因靶作为筛选测定，E基因靶进行确认性检测，特定序列的LOD低至0.22 pM的浓度。由于AuNIs附近局部PPT加热到一定温度(大约41C)还能够抑制相似但不完全匹配序列的杂散结合，因此有效避免了与高度相似的SARS-CoV RdRp序列发生交叉反应。该技术有效增强了准确区分相似序列的能力，改善了核酸检测的灵敏度与特异性[27]。

4 临床样本类型对核酸检测SARS-CoV-2的影响

核酸检测技术在针对不同类型样本检测时，其阳性检出率、灵敏度和特异性会有所差异。研究表明[28]，利用RT-PCR对8136份不同临床样本的阳性检出率进行对比分析，其中支气管肺泡灌洗液阳性率最高为91.8 %，其次是直肠拭子(87.8 %)、痰液(68.1 %)、鼻咽拭子(45.5 %)、粪便(32.8 %)、口咽拭子(7.6 %)、血液(1.0 %)，尿液中阳性检出率为0 %[29]。对于其他新型技术而言，不同样本类型亦有影响，如在收集的223份呼吸道样本中，LAMP检测鼻咽拭子观察到对SARS-CoV-2的最高灵敏度为98.96 %，痰液/深喉唾液样本灵敏度为97.02 %，口咽拭子灵敏度为98.33 %，且对所有样本特异性均为100.00 %[29]。

5 突变株对核酸检测技术的影响

截止2021年5月11日，SARS-CoV-2已演变出1281种不同的亚型或分支[30]，其突变类型主要包括错义、同义、插入、缺失、和非编码突变，其中以错义突变和同义突变最为常见，且这些突变主要集中在SARS-CoV-2的ORF1ab，S，N等基因[31]。世界卫生组织(world health organization，WHO)将重要变异株划分为“关切变异株(variant of concern，VOC)”和“关注变异株(variant of interest，VOI)”，截止2021年5月30日，WHO认定的关切变异株有501Y.V2、B.1.1.7、P.1、B.1.617，关注变异株有CAL.20C、B.1.526、B.1.525、B.1.616、P.2、P.3[1]。有研究表明，B.1.1.7变异株含有大量突变，这些突变可能会抑制引物与S基因的结合，导致RT-PCR的灵敏度降低，但目前已开发了多种变体特异性引物用以检测[32]。低频率存在或仅涉及单个碱基突变的变体在RT-PCR检测时易产生假阴性现象，但临床上多用双靶标或三靶标进行检测，因而仍可靶向另一个靶标基因检测到病毒的存在[1]。WHO流行病学报告显示，截止2021年5月25日，致病性较强、感染率较高的关切变异株对核酸检测的影响仍有限或暂无证据表明产生影响[1]。

6 小结

高效快速地对病原菌的检测是诊断感染性疾病的根本措施。目前，以检测快速，高灵敏度，特异性强为特征的RT-PCR仍然被作为全球新冠肺炎诊断的金标准。LAMP等新型技术高效快速，操作便捷，且具有较高的特异性和灵敏度，为COVID-19的早期诊断提供了更多的选择。每一种核酸检测技术各有其优劣，它们相互配合，可以更精确地诊断疾病、监测病毒变异。见表1。

表1 多种核酸检测技术的优劣对比