基于网络药理学和分子对接探讨防己黄芪汤治疗肾性水肿的机制与通路*

袁鑫，张林，欧祥琴，王喜红，唐阁，梁峰

（1．张家界市中医医院，张家界 427000；2．天津中医药大学，天津 301617；3．贵州中医药大学第一附属医院，贵阳 550001；4．天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；5．香港浸会大学中医药研究学院，香港 999077）

水肿是肾脏疾病最常见的临床表现之一[1]，多发于眼睑或颜面，进而蔓延至下肢，甚至全身，常伴有蛋白尿、血尿、高血压等其他临床症状[2]，其发病机制主要与肾小球滤过率改变有关，肾小球毛细血管内皮细胞过度增生，肾小球滤过率骤降，“球-管失衡”以致水钠潴留，发为水肿[3]。西医对肾性水肿的治疗多为对症处理，利尿剂虽显效较快，但易复发，且长期应用激素会导致激素依赖甚至激素抵抗，不利于患者远期康复。既往研究表明，防己黄芪汤对多种原因所致的肾性水肿效果显著[4-8]，并可逐渐降低激素使用量，减轻不良反应，但其具体机制仍未明确[9]。

中医本无肾性水肿之名，根据临床表现，可将其归属于“水肿”“血尿”“尿浊”等范畴，其病机不外乎本虚标实，虚实相兼，肺脾肾3脏虚为本；风寒湿热、浊毒侵犯、瘀血内生为标。治疗大法多以温补脾肾、温阳化气为主[2]。防己黄芪汤是《金匮要略》治疗风水的代表方，具有补气健脾、除湿祛风、利水消肿之功。其中防己、黄芪两者配伍，祛风利湿不伤表，固表止汗不留邪，白术健脾利湿，甘草调和药性，诸药相合，相得益彰。目前，防己黄芪汤治疗肾性水肿临床疗效已获肯定，各单味药化学成分亦有报道，但中药成分复杂，其相关机制研究仍不够全面。

网络药理学虽已广泛应用于药物靶点的预测，但尚缺乏实验或数据的支撑，说服力仍有待增强，故本研究在网络药理学基础上联合分子对接技术对其进行验证，通过分子对接的结合情况来探究靶点之间的亲和力，验证防己黄芪汤治疗肾性水肿相关通路的可行性，弥补网络药理学的不足，探求防己黄芪汤治疗肾性水肿的潜在分子机制，为临床疾病的治疗和相关实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 中药系统药理学数据库（TCMSP）（http：//lsp．nwu．edu．cn/tcmsp．php）筛选防己黄芪汤药物成分靶点；UniProt数据库（https：//www．uniprot．org/）筛选靶点蛋白对应的基因；OMIM数据库（https：//www．omim．org/）和 gene card 数据库（https：//genecards．weizmann．ac．il/v3/）检索肾性水肿相关的基因；String数据库（https：//string-db．org/cgi/input．pl）和 Cytoscape 3．7．1 软件作蛋白互作网络图；基于 R Stuidio1．2．5042版本的R 4．0．0语言做基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；利用PDB数据库（https：//www．rcsb．org/）搜索主要蛋白的结构式；采用PyMOL 2．4．0进行切除蛋白配体和分子对接演示；运用 AutodockTools 1．5．6 做网格盒子（Grid Box）；应用Autodock Vina做分子对接。

1.2 方法

1.2.1 药物成分筛选 采用TCMSP中药系统药理学技术平台检索防己黄芪汤化学成分，以药物成分的口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0．18为标准进行筛选，建立符合标准的成分数据列表。

1.2.2 肾性水肿相关靶标检测 采用genecard和OMIM数据库检索关键词为“Nephritis Edema，Primary nephritic edema，Secondary nephritic edema”的疾病基因信息，对目前公认的与肾性水肿（包括原发与继发）相关的疾病靶基因进行筛选，建立excel数据列表；通过Microsoft excel 2013软件的分列功能、Vlookup函数、Trim函数、宏程序等相关插件批量获取UniProt数据库的对应基因，并对靶点基因名称进行校正。

1.2.3 构建方剂成分-靶标-疾病网络示意图 通过R 4．0．0中的VennDiagram程辑包，对两份数据集取交集，得到防己黄芪汤与肾性水肿相关的潜在共同作用靶标，并通过Cytoscape 3．7．1软件进行多元素间的数据可视化处理。

1.2.4 通路富集分析 通过R4．0．0中的clusterProfile、pathview、org．Hs．eg．db 等相关生物包，进行防己黄芪汤与肾性水肿靶点的GO和KEGG富集分析。

1.2.5 分子对接验证 1）利用Cytoscape 3．7．1筛选出“药物-疾病”靶点蛋白度值（Degree）排名前5位的药物成分。2）应用TCMSP数据库下载相关成分的结构。3）根据配体同一性，应用PDB数据库下载对应蛋白。4）利用 PyMOL2．4．0 对蛋白去水、摘除配体。5）运用 Auto Docks Tools 1．5．6 根据配体曾经所在位置寻找Grid Box。6）使用Autock Vina进行分子对接，以结合能值评价受体与配体的结合情况。

2 结果

2.1 药物成分筛选结果 通过TCMSP数据库检索防己黄芪汤，设置OB≥30%且DL≥0．18，共检索到有效成分122个，其中防己3个，黄芪20个，甘草92个，白术7个，其中白术和黄芪共有成分1个，甘草和黄芪共有成分7个。防己黄芪汤部分活性化合物基本信息见表1。

表1 防己黄芪汤部分有效活性物质Tab.1 Part of effective active substances in Fangji Huangqi decoction

2.2 方剂-成分-靶标排名 根据2．1所搜索的药物成分，使用UniProt数据库，查询相关靶点基因的信息，共获得药物靶基因229个，并导入Cytoscape 3．7．1制作网络图，根据degree值筛选排名前5位的成分，见表2。

表2 根据Degree排名前5的成分和靶点Tab.2 Top five components and targets according to degree

2.3 肾性水肿靶标成分筛选 根据“Nephritis edema，Primary nephritic edema，Secondary nephritic edema”这3个关键词，使用OMIM、genecard数据库，共搜索到187个与肾性水肿相关的靶基因，与2．2所得的药物靶标取交集，共得到39个相交基因，交集基因信息见表3。

表3 药物-疾病靶基因交集Tab.3 Intersection of drug-disease gene

2.4 PPI网络图构建 将2．3所获取的药物与疾病靶标交集导入String网，物种选择Homo sapiens，将随机交互可信度设置为0．4，最低评分为0．4时为中等可信度，0．7表示高可信度，0．9表示最高可信度。本研究选用中等可信度的PPI网络，下载对应的TSV格式网络图，将R4．0．0的靶点作条形图，见图1；Cytoscape 3．7．1 作 PPI网络图，见图2。

图1 蛋白互作条形图Fig.1 Barplot of protein interaction

图2 蛋白互作网络图Fig.2 Network of protein interaction

条形图显示了蛋白互作度，由图可知，较为重要的蛋白分别是白介素（IL）-6（34）、肿瘤坏死因子（TNF）（34）、血管内皮生长因子（VEGFA）（33）、腺苷酸激酶同工酶（ATK1）（31）、IL-10（31）等。网络图中，蛋白互作度越大，所对应的颜色越深。

2.5 GO功能和KEGG富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用 R4．0．0 中的 org．Hs．eg．db和clusterProfiler包对防己黄芪汤的预测靶点进行 GO 功能富集分析，pvalue Cutoff=0．05，qvalue Cutoff=0．05，提取核心交互靶点20个，蛋白的作用机制主要与细胞因子活性、细胞因子结合受体、受体配体活动、生长因子活性等因素有关。见图3。

图3 GO富集分析Fig.3 GO terms enrichment

2.5.2 KEGG 富集分析 利用 R4．0．0 中的 org．Hs．eg．db和clusterProfiler包对防己黄芪汤的预测靶点进行KEGG通路富集分析，设定pvalue Cutoff=0．05，qvalue Cutoff=0．05，共得到 108 条通路，提取核心通路20个，见图4。防己黄芪汤治疗肾性水肿的主要通路有晚期糖基化终产物与晚期糖基化终产物受体（AGE-RAGE）通路、疟疾通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、TNF通路、低氧诱导因子信号通路等。AGE-RAGE通路富集情况。见图5。

图4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment

图5 AGE-RAGE通路富集情况Fig.5 AGE-RAGE signal pathway

2.6 分子对接验证 根据蛋白互作图中排名前5位的蛋白（IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10），在 PDB数据库中进行检索，共检索出IL-6 23个，TNF 599个，VEGFA 41个，ATK1 0个，IL-10 15个。以配体作为筛选项，根据排名前5药物成分（槲皮苷、山奈酚、芒柄花黄素、异鼠李素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮）的分子结构选择对应的蛋白，经化学结构筛选，发现TNF-α抑制剂3EWJ和3E8R的配体结构与药物成分结构类似，故对其进行分子对接验证。

经 PyMOL 2．4．0去除水分子后切除 3EWJ的配体642，切除3E8R的配体615，保存为pdb格式，使用 AutodockTools 1．5．6 把文件格式统一转换成pdbqd，并根据原配体所在位置设置网格盒子相关参数，根据参数使用Autodock Vina做分子对接。

一般认为分子对接时，结合能值越低，对接构象越稳定，发生作用的可能性越大，结合能小于0说明配体和受体可自发结合[10]。对接结果见表4，根据分子结合能打分比较，可见山奈酚与3EWJ和3E8R的对接结合能最低，山奈酚与3EWJ和3E8R对接时，结构稳定。

表4 防己黄芪汤核心成分与3EWJ和3E8R的分子对接结果Tab.4 Molecular docking results of Fangji Huangqi decoction with 3EWJ and 3E8R

3 结论

防己黄芪汤可能通过槲皮素、山奈酚、异鼠李素等化学成分作用于 IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10等因子，进而调控AGE-RAGE和TNF信号通路以发挥治疗肾性水肿的药效作用。

4 讨论

本研究通过TCMSP数据库获得防己黄芪汤的化学成分共122种，基于该活性成分的预测靶点共229个，肾性水肿的靶基因共189个，其中疾病基因与药物基因配对且符合评分0．4的PPI网络靶点共39个，选择度值最大的5个靶点做分子对接验证。

所得出的5个最大度值靶点中（IL-6，TNF，VEGFA，ATK1，IL-10），IL-6 和 TNF-α 在防己黄芪汤的治疗中研究较为广泛。在人体研究中，杜卫军等学者[11]认为防己黄芪汤能通过IL-6、TNF-α改善肾病综合征患者的炎性反应；李玉卿等[12]的随机对照研究发现防己黄芪汤能明显降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平，改善慢性肾炎患者的微炎症状态。在动物研究中，俞东容等[13]认为防己黄芪汤能调节单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中TGF-β、BMP-7的表达，减轻肾脏损害；范颖等[14]通过阿霉素诱导肾病大鼠模型，发现防己黄芪汤能有效抑制大鼠肾组织转化生长因子-β1（TGF－β1）、白细胞介素-18（IL-18）的表达，改善炎症反应，进而抑制肾小管转分化、肾小管萎缩；李武等[15]在慢性肾衰大鼠模型中发现防己黄芪汤可下调VEGFA的表达，且VEGFA和AKT与肾脏纤维化存在一定的相关性[16]，这可能与PI3K/AKT/VEGFA通路有关[17]。上述研究表明，防己黄芪汤可通过调节 IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10来发挥治疗肾性水肿的药效作用，且这些因子与AGERAGE和TNF信号通路有关。

在52个GO富集分析中，多为细胞凋亡和增殖、炎性反应、应激反应等。细胞因子活性、生长因子活性可能是防己黄芪汤治疗肾性水肿的关键生物学过程。研究发现，糖尿病肾病患者外周血单核细胞组织因子促凝活性明显升高，这可能与糖尿病肾病的发病机制、病程进展相关[18]。

在108个KEGG通路中，AGE-RAGE信号通路、疟疾信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、低氧诱导因子信号通路的度值排名最为靠前。AGE-RAGE通路可通过改变蛋白质的生理功能、触发细胞级联反应，导致滤过屏障解体、引发氧化应激和肾脏纤维化，加快慢性肾脏病的进展[19]。肾小球AGE的积累可使单核细胞趋化蛋白1（MCP－1）高表达，促进巨噬细胞聚集，导致细胞外基质积累及肾纤维化。糖尿病肾病发展的重要机制包括AGE-RAGE信号通路，此机制可激活核转录因子-κB（NF－κB），促进 VEGF 和 TGF－β1的产生，最终会引起氧化应激，加速肾功能恶化[20]。在糖尿病肾病的研究中，一项生物信息学研究[21]指出，防己黄芪汤治疗2型糖尿病与AGE-RAGE信号通路有关；黄芪对肾小球系膜细胞具有一定的保护作用，黄芪桂枝五物汤可通过阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路中组织细胞表面RAGE的表达、抑制NF-κB激活及其引发TNF-α触发的氧化应激和炎症反应，从而减轻糖尿病大鼠神经病变[22]。而如图4所示，TGF-β1、TNF-α、VEGF 均是AGE-RAGE 的重要组成，故防己黄芪汤治疗糖尿病肾性水肿的机制可能与AGE-GARE通路有关。对其余3条通路进行分析，疟疾通路与肾损伤关系密切，疟疾可通过减少血容量[23]，促进血管收缩、溶血、肾小球免疫复合物沉积、微循环功能障碍和横纹肌溶解[24]而致肾损伤；流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路可以激活 NF-κB、MAPK，促进肾脏炎症发生[25]；低氧诱导因子信号通路可诱导肾小管炎症反应和肾间质纤维化形成[26]。通过分子对接技术验证网络药理学结果，在分子对接模型中，TNF-α抑制剂3EWJ和3E8R的配体结构与药物成分结构类似，分子对接模型显示对接结果良好，配体与受体能主动结合，提示3EWJ和3E8R可能是山奈酚与TNF作用的靶蛋白，TNF是AGE-RAGE和TNF通路的重要组成部分，分子对接结果支持AGE-RAGE与TNF通路。

以上实验均为本研究所得出的相关通路提供了一定的实验依据，5条信号通路均可能是防己黄芪汤治疗肾性水肿的关键通路，但结合既往研究与分子对接验证结果，笔者认为肾性水肿的通路更可能与AGE-GARE和TNF信号通路有关，这两条通路研究较为广泛。既往研究发现加味防己黄芪汤能够通过调控TNF-α、IL-10进而减轻肾脏的炎性反应，降低原发性肾病综合征患者IL-1β、IL-6、IL-10[27]及TNF-α的表达水平，上述相关因子在两条通路中均有表达，故防己黄芪汤很可能通过调控AGE-RAGE和TNF信号通路而改善肾性水肿。

综上所述，本研究通过网络药理学方法和分子对接技术，初步探讨了防己黄芪汤治疗肾性水肿的潜在作用机制。文章虽通过TCMSP得到防己黄芪汤的有效化学成分，但中药成分之间相互作用复杂，且复方制剂影响因素较多，后期可通过UPLC、UPLC-Q-TOF-MS等方法对防己黄芪汤成分进行检测，本课题组将在后续研究中设计相关实验以进行验证。