人不同部位泪道黏膜及上皮干细胞的免疫组织学研究*

刘 荣,谭咏耀,李贵刚,罗 班,胡维琨,2△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科,武汉 430030

2武汉科技大学附属天佑医院眼科,武汉 430064

泪道阻塞性疾病包括泪道不同部位的狭窄、阻塞、慢性泪囊炎,是危害人类健康的常见眼部疾病[1-2]。它的发病机制尚不明确,有学者推测炎症在其中起重要作用,认为眼部炎症下行或鼻部炎症上行,使泪道黏膜充血水肿,导致泪道暂时性阻塞;而反复的炎症使泪道黏膜上皮坏死及黏膜下组织结构发生纤维化改变,进而导致该段泪道的永久性闭塞或功能丧失[3]。我们通过兔泪囊炎模型也观察到鼻泪管阻塞后泪囊及阻塞位点上方的鼻泪管黏膜出现炎性水肿,逐渐发展至上皮坏死脱落的过程[4-5]。泪道黏膜上皮的完整性无疑是保持泪道通畅和正常功能的重要因素。在临床工作中,我们通过对泪小管断裂修复后及泪道阻塞疏通成功病例的泪道内窥镜观察可以看出,泪道黏膜上皮有一定的自我修复功能。我们推测泪道黏膜中存在着上皮干细胞,是黏膜上皮细胞再生修复的源泉。如果能够成功鉴定及培养出该干细胞,将为泪道阻塞的治疗提供新的研究思路及方法。泪道由上泪道(泪点、泪小管、泪总管)和下泪道(泪囊、鼻泪管)构成,上、下泪道的黏膜组织结构不同,其上皮干细胞定位及鉴定的区别尚未见报道。本研究通过解剖人新鲜尸体,获得全泪道黏膜标本,进行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化染色,了解其解剖特征,探寻上皮干细胞在不同部位泪道黏膜的定位。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验获得华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会批准。选取2具新鲜尸体(同济医学院基础医学院解剖学系提供)。包括男性尸体1具,60岁;女性尸体1具,57岁。对2具尸体共4个泪道组织进行了取材及解剖,将不同部位的泪道组织做组织学切片及染色分析。

1.2 大体解剖

在内眦旁做弧形皮肤切口,上方达内眦水平线上0.5 cm,下方达内眦水平线下0.5 cm,然后切口向下沿着鼻旁延伸约2.5 cm至鼻翼上方;内眦部切口下分离皮下组织及肌肉层,离断内眦韧带,暴露泪囊,沿着泪囊窝将泪囊壁剥离;鼻旁切口下分离达骨质,咬骨钳咬掉骨性鼻泪管前壁,暴露膜性鼻泪管;沿着泪小管走行方向将包含泪点、泪小管的眼睑组织剪下,该组织与泪囊相连,用剥离子在骨性鼻泪管末端将膜性鼻泪管与骨壁剥离,将整个泪道组织取出。用泪道探针标记泪道管腔,显微镜下仔细去除多余的皮肤、结膜及肌肉等组织,保留厚约1 mm的包含泪道黏膜的组织。

1.3 组织切片观察

将完整泪道黏膜组织分成上下泪点、上下泪小管中部、泪总管、泪囊上部、泪囊中部、鼻泪管上部、鼻泪管下部9个部位,经甲醛固定后石蜡包埋,行HE染色。选取其中有代表性的切片(下泪小管中部,泪囊中部,鼻泪管上部)行波形蛋白Vimentin(VIM,Abcam公 司,ab16700)、转 录 因 子p63α(p63α,CST公司,13109)、原癌基因c-kitproto-oncogene protein(c-Kit,Abcam公司,ab32363)、细胞角 蛋 白Cytokeratin 19(CK19,Abcam公 司,ab52625)与广谱细胞角蛋白Pan Cytokeratin(PCK,Abcam,ab7753)的双抗荧光染色,操作按照试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 大体观察

在显微镜下将多余的皮肤、肌肉、结膜组织去除,保留泪道管腔及黏膜组织。可见整个泪道连续,上下泪小管汇合为泪总管,泪总管末端膨大为泪囊,泪囊与下方鼻泪管之间无明显界限(解剖时见到骨性鼻泪管开口可判断泪囊与鼻泪管界限)。将泪点开口处1 mm取材为泪点,泪小管中间段2 mm取材为泪小管中部,泪总管中间段1 mm取材为泪总管,将泪囊顶端1 mm组织取材为泪囊上部,将其在泪总管开口下端2 mm组织取材为泪囊中部,将骨性鼻泪管起始部位内的膜性鼻泪管往下取材2 mm记为鼻泪管上部,其末端取2 mm为鼻泪管下部(图1)。

图1 泪道黏膜标本Fig.1 Lacrimal mucosa specimen

2.2 HE染色

HE染色结果显示:上下泪点、上下泪小管、泪总管表现类似,均为复层扁平上皮:表层细胞为扁平状,中间的数层细胞为多角形,最深层的基底细胞为矮柱状(图2)。泪囊上部、泪囊中部、鼻泪管上部、鼻泪管下部的表现相似,上皮可分为浅层的柱状上皮和基底的扁平上皮。其中泪囊上部的黏膜较厚,可见较多粗大的杯状细胞,泪囊下部的黏膜上皮相对薄,鼻泪管上部与泪囊下部组织结构接近,黏膜上皮浅层的柱状上皮细胞连接紧密,亦可见杯状细胞,鼻泪管下部可能因组织挤压出现上皮脱落,但仍可见未脱落部分的上皮组织结构与鼻泪管上部接近(图3)。

图2 上泪道黏膜的苏木精-伊红染色(×400)Fig.2 HE staining of upper lacrimal duct mucosa(×400)

图3 下泪道黏膜的苏木精-伊红染色(×400)Fig.3 HE staining of lower lacrimal duct mucosa(×400)

2.3 免疫组化染色

所选取的3个代表部位(下泪小管中部、泪囊中部、鼻泪管上部)的免疫荧光染色表现有一致性,上皮细胞的PCK及CK19染色阳性,c-Kit及VIM染色均阴性,基底层细胞的p63α染色阳性(图4)。

图4 不同部位泪道黏膜的免疫荧光染色Fig.4 Immunofluorescence staining of lacrimal duct mucosa in different parts

3 讨论

通过在临床工作中的观察,我们发现泪道上皮具有一定的自我更新及修复能力。比如泪小管断裂后经吻合可以实现泪道再通[6];泪点部分切除及泪点成型再造手术后可以重新长成一个具有光滑黏膜的新泪点;泪小管切开后可以愈合等[7]。笔者曾用泪道内窥镜检查泪小管断裂吻合术后痊愈的患者,其吻合部位的泪小管黏膜是光滑的。这些临床现象都证明泪道上皮具有自我更新能力,可以猜测其自我更新能力很可能来源于上皮干细胞,但目前人们对泪道上皮干细胞知之甚少。2018年本团队首次报道了利用泪小管黏膜培养出泪小管上皮干细胞的方法[8],我们发现所培养的细胞有类似于角膜缘干细胞的增殖能力强,呈干细胞克隆样结构的特点。但如何特异性鉴定泪道上皮干细胞?在不同部位的泪道上皮及其干细胞是否有区别?带着这样一些疑问,我们设计了本实验。

本研究发现,泪小管的不同部位均为复层扁平上皮。其表层为扁平状,中间的数层细胞为多角形,最深层的基底细胞为矮柱状,这与分布于皮肤、口腔等处的上皮类似。这类上皮较厚,具有机械性保护作用,这一类上皮的基底细胞常常为具有增殖分化能力的干细胞,通过有丝分裂增生新的细胞,不断补充表层脱离的细胞[9]。而泪囊与鼻泪管的上皮表现接近,均为表层的柱状上皮和基底的扁平上皮。从图片可以初步看出位于泪囊上部的上皮较厚,有较多粗大的杯状细胞,这也许是泪囊炎发生时患者常有黏液样分泌物的原因。而鼻泪管下部的上皮较薄,更容易看出假复层柱状上皮的结构。当然,上皮的厚度也许还和黏膜当时的状态相关,比如炎症早期极有可能出现黏膜增厚的改变。我们用兔制备泪囊炎动物模型,在炎症发生后不同时期观察了泪道黏膜上皮的变化,发现其出现从增厚、炎症细胞浸润到上皮逐渐坏死脱落的过程。

既然上泪道与下泪道的黏膜组织结构不同,其干细胞定位是否有区别呢?对于干细胞的研究,首先需要寻找到特异性的干细胞标记物。PCK可用于多种上皮细胞的标记[10]。因此,本实验把PCK与可能的干细胞因子同时染色,以寻找可能的泪道上皮干细胞。在本实验中可看到无论是泪小管还是泪囊鼻泪管,通过PCK的着色,均可以把上皮细胞标记出来。CK19是上皮细胞特有的标志物,在一些特有的上皮细胞(如支气管上皮、肠上皮、胰腺上皮等)及一些组织前体细胞中高表达[11],比如CK19被认为是皮肤干细胞的标志物[12]。在本研究中,我们发现所有部位的泪道上皮均表达CK19,与PCK的表达类似。因此,CK19可以作为泪道上皮的鉴定因子,但不能作为泪道上皮干细胞的鉴定因子。干细胞因子(stem cell factor,scF)是一种重要的造血因子,对正常造血细胞、肥大细胞、黑色素细胞、生殖细胞的增殖和分化等起着重要的调节作用,其受体是由原癌基因c-Kit编码的一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白c-Kit[13-14]。经过检测,泪道上皮细胞未见c-Kit蛋白表达。VIM是存在于间充质细胞中的一种中间丝蛋白,是成纤维细胞的标志分子[15],在泪道上皮中也未见阳性细胞表达。

p63是p53基因家族的新成员,是一种核转录因子蛋白,与抑癌基因p53具有同源性的编码基因,p63基因在人体组织中呈广泛而有选择性表达,尤其在增生上皮组织的基底层,对于正常上皮的形成具有重要意义[16],它被认为是上皮干(祖)细胞的标记物。p63蛋白也可作为增殖潜力的标记物[17]。p63基因至少编码6种异构体,分为两大类:从外显子1开始转录具有反式激活区的异构体称为TA异构体;从另一个位于外显子3和4之间的外显子3′开始转录的没有反式激活区的异构体称为ΔN异构体。每一类由于3′端剪切方式的不同而产生3种C末端不同的异构体,又分为α、β和γ,其中α异构体为全长的异构体,β异构体为剪切掉外显子13的异构体,γ异构体为剪切掉外显子11-14的异构体[18]。在不同的组织中可能以不同的亚型为主。p63α被用作角膜缘上皮干细胞的标志之一[19],在本实验中,我们发现在泪道上皮的基底层有p63α的表达,可以将其作为泪道上皮干细胞的标记物。

本实验中我们首次发现,尽管上下泪道的黏膜上皮细胞构成不同,但在其底部均有p63α染色阳性的基底层细胞,为潜在的上皮干细胞。PCK及CK19可标记泪道上皮细胞,其与p63α的复合染色可标记泪道上皮干细胞,这为进一步研究打下基础。未来我们将分别培养上下泪道的干细胞,进一步研究并比较其特征与功能。