AFP阴性HCC早期筛查和诊断的生物标志物研究进展

王华 尹伟 张云 李成忠

原发性肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，每年全球新增约90万新发病例和83万死亡病例，其中近一半的新发病例和死亡病例集中在我国[2]，严重威胁我国人民的身体健康，给社会公共卫生带来沉重的负担。受人群中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)高感染率的影响，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ，HCC)是我国原发性肝癌的主要病理学类型[3]，85%～90%的原发性肝癌为HCC[4]。HCC的恶性程度通常较高，且多数HCC患者起病隐匿，早期多无明显症状，近80% 的患者确诊时已属中晚期，从而错过最佳治疗时机，因此HCC的早期筛查和诊断极其重要。AFP是目前应用最广的诊断HCC重要的生物学标志物，国内外各大指南和共识推荐使用，但临床中发现AFP易受一些非HCC疾病(肝炎和肝硬化等)的影响[3]，对于早期HCC和小HCC，其诊断能力较低，并且有30%～40%的HCC患者AFP阴性或低于临界值。为了弥补AFP的缺点，提高诊断模型的敏感性和特异度，国内外学者尤其对AFP阴性HCC患者早期筛查和诊断进行了大量的研究，本文对有望用于AFP阴性HCC患者早期辅助诊断的生物学标志物做一综述。

一、凝集素反应性甲胎蛋白(lensculinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein ，AFP-L3)

AFP-L3是一种异常糖基化的AFP，是根据AFP的两条复合糖链亚结构的不同而衍生出AFP异质体。血清AFP-L3值的升高与癌变的肝细胞分泌较多的AFP-L3有关，并且AFP-L3占血清AFP的百分比受总的AFP水平和其他疾病影响较小。

Hidenori等[5]研究纳入AFP<20 ng/mL的270例的HCC患者和396例慢性肝病患者，采用新一代高灵敏度分析方法检测血清AFP-L3(%)。当AFP-L3(%)取5%为临界值时，诊断AFP阴性HCC的灵敏度和特异度分别为41.5%和85.1%，高于常规检测方法。这与Zhang Z等[6]的近期研究结果相近，该研究显示AFP-L3诊断AFP阴性HCC的AUC为0.6094，灵敏度为50%，特异性为97.5%，准确性为79.2%。Kumada等[7]的研究还发现，在AFP阴性HCC患者中，出现影像学阳性前的3～18个月即有AFP-L3(%)值升高，34%的HCC患者在确诊1年前即出现AFP-L3(%)显著升高，并且AFP-L3(%)可用于预测HCC患者预后，AFP-L3≥7%的患者生存率明显低于AFP-L3 < 7%的患者。但也有研究[8-10]认为AFP-L3单独用于诊断早期HCC及AFP阴性HCC的灵敏度较低，用于鉴别HCC和肝硬化准确性较差。可能原因是各研究采取的AFP-L3检验方法、病例纳入标准和数量存在差异所致。因此，AFP-L3用于AFP阴性HCC早期诊断目前还存在争议。从以上的研究结论看，AFP-L3单独用于AFP阴性HCC早期诊断的灵敏度并不高，还缺乏统一公认的界值，临床实践中可能需要联合其他标志物。

二、脱-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)

DCP是癌变的肝细胞产生的异常凝血酶原，其机制可能与癌细胞对维生素K的利用障碍、依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶活性降低有关。

Chen H等[8]发现血清DCP在CHB相关HCC中的表达水平明显高于单纯CHB患者和健康人群，早期诊断 HCC 的AUC 值为 0.82，敏感度为 65.2%，特异度为 90%，明显优于AFP-L3，对AFP阴性和阳性HCC患者具有相似的诊断价值。 Wang X等[11]人研究同样针对HBV相关HCC和CHB患者，结果发现血清 DCP诊断AFP阴性HCC的AUC值为0.73，稍低于Chen H等的研究，但在早期诊断小肝癌(肿瘤<2 cm)方面具有一定价值(AUC值为0.69)。Ji J[12]等的一项多中心的队列研究中，血清DCP在AFP 阴性 HCC早期诊断的AUC为0.856，高于Liu Z等[13](AUC值为0.685)的研究，稍低于Xu F[14]等(AUC值为0.858)和Feng H等[15]人的研究(AUC值为0.88)。而卫荣荣[16]等发现患者血浆DCP取界值61 mAU/mL，诊断AFP阴性HCC的AUC值为0.858，敏感度为72.8%，特异度为88.2%，并且血浆DCP值与肿瘤大小和TNM分期正相关。目前血浆DCP用于AFP阴性HCC的研究较多，且多数认为具有一定价值，但还缺乏统一的检验方法和公认的界值。

三、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)

OPN是一种分泌型磷酸化蛋白质，在健康人体肾脏和骨骼等组织中少量表达。病理情况下，OPN可在人体多种肿瘤组织中高表达，具有促进肿瘤细胞趋化、粘附、侵袭和迁移等重要作用。肝细胞在癌变或遭受炎症损伤时分泌OPN增加并进入血液[17]。

Shang S等[18]的研究发现HCC患者血浆OPN显著高于肝硬化患者和健康人群(P<0.05)。在诊断HCC的前一年即可检出血浆OPN值升高，并且OPN对AFP阴性HCC的早期诊断也有较好的敏感性(AUC值为0.75)。Zhu M等[19]的一项小样本研究分析得出相似结论，在AFP阴性HCC患者中，OPN诊断性能良好，AUC为0.838，敏感性达78.26%，特异性为80.45%。另外，Ge T等[20]和Mona M等[21]的研究同样认为血浆OPN对HCC的早期诊断优于AFP，并能有效鉴别早期HCC和肝硬化。诊断HBV相关HCC的 AUC值为0.908，灵敏度为89.89%，特异度为82.06%，这与早期的一项血浆OPN应用于HCC早期诊断的荟萃分析[22]结论相似(合并敏感度和特异度分别为88%和87%)。以上研究表明，血浆OPN对HCC的早期诊断具有一定的价值，但目前针对AFP阴性HCC的研究不多，并且OPN检测尚未建立国际公认的参考方法，以及血浆OPN值受非肝脏系统肿瘤的影响较大，可能限制了其在临床实践中的应用。

四、循环游离DNA(circulating Cell-Free DNA,cfDNA)

cfDNA是由细胞凋亡或者坏死后释放带外周血的细胞外DNA分子。cfDNA在肝细胞癌等各种恶性肿瘤中升高，并具有癌症特异性DNA改变，是一种特征性的肿瘤生物标志物。许多具有高敏感性和特异性的方法有助于将cfDNA作为一种“液体活检”用于肝细胞癌的诊断、预后和疗效监测。

Xiong Y等[23]发现血浆cfDNA对诊断HCC有价值(AUC为0.92，灵敏度为65%，特异度为100%)，ctDNA与AFP联合时，诊断AFP阴性HCC的AUC为0.96，灵敏度为73%，特异度为100%。此外，Wang T等的一项研究[24]使用实时定量 PCR 技术检测 HCC患者血浆中的cfDNA相关荧光和血清自身荧光，该研究发现cfDNA相关荧光强度和血清自身荧光强度在诊断早期(BCLCA期)、小(肿瘤大小≤3 cm)和AFP阴性HCC中具有较好的诊断效能。在鉴别肝硬化、慢乙肝、健康对照组时，训练集和验证集的AUC值分别为0.777～0.963和0.764～0.972。在鉴别AFP阴性与非HCC时AUC 为0.836，敏感性为73.6%，特异性为79.7%。而且联合AFP、肝功能检查、血细胞分析等指标时可提高其诊断价值[25]。然而， 血浆中总cfDNA含量低，检测技术难度和成本较高，影响因素尚不明确，缺乏国际公认的参考方法，可能限制了其进一步的推广应用，但随着研究的深入，作为“液体活检”的cfDNA检测技术必定有广阔的应用前景。

五、C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)

CRP是一种敏感的炎症和组织损伤标志物。在一些实体肿瘤中可检测到CRP表达升高，血清CRP升高与恶性肿瘤的不良预后相关。一项研究[26]纳入了HBV相关的AFP阴性HCC患者74例，结果显示65.9%的AFP阴性HCC患者血清CRP阳性，AFP阴性HCC患者CRP表达的AUC为0.724，敏感性和特异性分别为72.97%和60%，该研究表明CRP可作为AFP阴性的HCC诊断的辅助生物标志物。Maetal等[27]人使用了一种高灵敏度CRP分析，发现血清hs-CRP诊断HCC时的AUC为0.903，而且对于AFP阳性和AFP阴性HCC患者诊断阳性率相近(86.9%vs84.6%)。此外，另一项研究[28]也发现在AFP阴性和AFP低水平(<100 μg/mL)的HCC患者中，CRP水平有明显的升高 。以上研究表明血清CRP作为辅助诊断AFP阴性HCC的生物标志物具有一定前景。但是易受其他疾病影响，目前相关研究样本量较少，研究结果需要在更大队列研究中进一步验证。

六、基于新标志物的联合诊断在AFP阴性HCC中的价值

(一)基于新标志物和免疫学、生化学指标的联合诊断模型 常规实验室检测是一个包含许多相关疾病信息的巨大数据库，为疾病的诊断和预后提供简单、经济、有效的预测方法。多项研究表明，系统性炎症和代谢异常参与HCC的诊断和进展，如前白蛋白[29]、D-二聚体[29]、谷氨酰转肽酶[30]等。Wei J等[29]的研究发现AFP阴性HCC患者D-二聚体水平明显高于对照组，诊断AFP阴性HCC的AUC值为0.868(P<0.05)；同时该研究显示AFP阴性HCC患者前白蛋白明显低于对照组，诊断AFP阴性HCC的AUC值为0.900(P<0.05)，两者联合诊断的AUC高达0.941，敏感性和特异性分别为85.7%和89.2%。另一项研究[31]发现纤维蛋白原与前白蛋白比(FPR)和谷氨酰转肽酶与血小板比值(GPR)单一或联合时，可作为AFP阴性HCC经济、简单、有效的生物标志物，两者联合在区分健康对照组AUC高达0.977。而Li J等[32]在一项研究中发现，γ-谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶比值联合γ-谷氨酰转肽酶和天冬氨酸比值和丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶比对AFP阴性HCC有较好的诊断能力，在区分健康对照组、AFP阴性CH组、AFP阴性LC组时AUC值分别为0.857、0.733、0.713，诊断价值稍低于Huang L等[31]的研究。此外，一项纳入171例AFP阴性HCC患者的回顾性研究[33]中，结合多个常见的血液学参数(平均血小板体积、红细胞分布宽度、平均血小板体积、中性粒细胞/淋巴细胞比、血小板计数/淋巴细胞比)建立Logistic模型，该模型诊断AFP阴性HCC的 AUC为0.922，敏感性和特异性分别为83.0%和93.1%。并且该模型在来自不同医院的试验中进行了验证。以上研究表明常见血液学参数联合可能有助于AFP阴性HCC的早期诊断，为AFP阴性HCC早期诊断提供新思路。

(二)多个新标志物联合诊断模型 既往的研究中，有学者开发出一些多个生物标志物联合使用或者新标志物联合传统指标的模型，可以进一步提高诊断敏感性，有效克服单个标志物准确度较低的缺点。GALAD评分系统[34]是基于肝细胞癌患者的年龄、性别、AFP、AFP-L3、DCP水平构建的模型，该模型诊断AFP阴性HCC的特异性为93.3%，敏感性为85.6%。Xu F等[14]的研究发现，DCP联合AFP较DCP单独用于诊断HCC具有更好的诊断性能。Zhang Z等[6]人的研究表明AFP-L3联合使用GP-73可提高AFP阴性HCC诊断准确性和敏感性(敏感性40.0%、特异性100%、准确性76.9%)。以上研究显示多种生物标志物联合可提高诊断的敏感性和特异性。近期一项回顾性研究[35]构建了基于AFP和5个常用的临床指标(年龄、APTT、ALP、钠离子、氯离子)的诊断模型，该模型诊断AFP阴性HCC AUC为0.854，敏感性、特异性、准确性分别为68.5%、86.6%、80.9%。此外，Zhu L等[36]的一项回顾研究发现AFP联合血小板和丙氨酸转氨酶比值(APAR)的诊断模型,在鉴别AFP阴性(<20 ng/mL)HCC与非癌对照组和慢乙肝患者时, AUC分别为0.839和0.746，研究结果证明该模型在低AFP或AFP阴性中是一种有效的HCC筛查模型。以上研究表明，多个生物标志物联合或者新标志物联合传统指标或实验室常规指标，可以进一步提高诊断敏感性。目前多种生物标志物联合诊断AFP阴性HCC的模型较多，但同样受制于检测方法、界限值的影响；除此以外，联合诊断模型如何能简便、易于实现地协助早期诊断，还有待于进一步的研究进行大量的临床验证和调整。

七、总结和展望

早期诊断HCC并进行有效的治疗是改善预后的关键，AFP是目前应用最广泛的HCC诊断指标，而AFP阴性HCC则缺乏理想的生物标志物。前期已有较多研究提示一些生物标志物和常见实验室指标单独或联合有望解决这些问题。从以上的研究来看， AFP-L3单独用于AFP阴性HCC早期诊断的灵敏度并不高，随着AFP-L3检测方法灵敏度的提高，其辅助诊断AFP阴性HCC的灵敏度和特异度可能进一步提高。DCP对AFP阴性HCC患者具有良好的诊断性能，尤其是AFP、AFP-L3、DCP联合检测可进一步提高诊断的敏感性和特异性。OPN、CRP对AFP阴性HCC具有辅助诊断价值，但易受其他疾病影响。作为“液体活检”，cfDNA在AFP阴性HCC中诊断价值较高，但其检测技术难度、成本较高，影响因素尚不明确。以上标志物单独用于AFP阴性HCC的诊断准确性较低，多种生物标志物联合在临床实践中能一定程度弥补AFP的不足，对早期诊断AFP阴性HCC具有较高的准确度。此外，已有较多研究发现常用生物标志物联合实验室检验指标在诊断AFP阴性HCC方面具有较好的诊断效能。但是，目前各研究病例的纳入条件和新型标志物的检测方法等并不完全相同，不同研究结论之间还存在一定差异，在此基础上得到的诊断界值也不准确，应用于人群中筛查时可能影响结果的评定，在实际应用过程中还需综合判断。目前多种新型肿瘤标志物已被提出，包括高尔基蛋白-73(GP73)，Glypican-3(GPC-3)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、MicroRNAs等。然而，目前尚没有研究显示出在AFP阴性HCC的早期诊断中具有足够的敏感性和(或)特异性，未来需要进一步开展更多的大样本研究。因此，需要寻找更加理想的AFP阴性HCC筛查方法辅助临床医生进行早期诊断。理想的肝癌预测方法应是非侵入性的、准确的、可获得的和相对廉价的。从丰富的常规实验室检查中挖掘隐藏信息，建立疾病预测模型，为临床实践提供更经济和无创的诊断方法。在未来，对于血清低AFP或AFP正常的患者，我们需开发一些简单的模型，包括常规的实验室变量，来辅助预测肝细胞癌，帮助临床医生初步确定HCC发展的特定风险患者，可作为血清AFP及超声检查的有力补充。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。