GO-CoA-Tat对非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝损伤保护作用

张绍仁 胡静娴 周皓 蒋淼 樊晓明

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)发病机制复杂，可能与肥胖症和2型糖尿病等代谢紊乱密切相关，目前尚无有效治疗方法[1-5]。饥饿素O-酰基转移酶(ghrelin o-acyltransferase, GOAT)是饥饿素(Ghrelin)特异的酰基化转移酶[6, 7]。有研究提示GOAT-Ghrelin在能量代谢、脂质代谢等环节发挥重要调节作用[8, 9]。GOAT拮抗剂GO-CoA-Tat是一种基于多肽的双底物类似物，腹腔注射可改善小鼠血葡萄糖耐量及减少食物摄入[10-12]。GO-CoA-Tat能否调节肝脏脂质代谢尚不清楚。本研究探索GO-CoA-Tat对小鼠肝脏脂肪变性和脂肪性肝炎相关炎症指标的作用。

材料与方法

一、动物饲养和处理方案

雄性C57bl/6小鼠18只，8～10周龄，体质量(23.0±2.0)g，购自上海灵昌生物科技有限公司。高脂饮食(high fat diet, HFD)饲料(D12492，上海睿安生物有限公司)用于诱导小鼠肥胖及脂肪肝。小鼠在23℃环境下标准方法饲喂，随机分成3组，每组6只。正常组：给予小鼠正常饮食。HFD+Saline组：小鼠HFD喂养8周，每周1次腹腔注射0.9% NaCl溶液。HFD+GO-CoA-Tat组：小鼠HFD喂养8周，每周1次腹腔注射GO-CoA-Tat 96 μg/kg。所有小鼠在第8周处死，采集肝脏样本和血液进行组织学和血清学分析。

二、生化检测

微孔板检测试剂盒(上海闪谱生物公司)测定血清ALT、AST、TG、TC和GLU水平。细胞脂质测定试剂盒(上海闪谱生物公司)检测小鼠肝脏三酰甘油浓度。

三、实时定量反转录聚合酶链反应

分离总RNA，SYBR Green PCR依据生产商的操作流程进行。总RNA提取采用TRIzol试剂盒。使用7900HT Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems，美国)进行SYBR Green定量RT-PCR，依据SYBR Premix EX Taq(TaKaRa生物公司)操作介绍确定靶基因表达，引物序列GAPDH：上游5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′；下游5′-GAG-TTGTCATATTTCTCGTGG-3′，产物长度149 bp。TNF-α：上游5′-CACCACTTCGAAACCTGGGA-3′；下游5′-TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT-3′，产物长度105 bp。IL-6：上游5′-TCAATATTAGAGTCTC-AACCCCCA-3′；下游5′-TTCTCTTTCGTTCCCG-GTGG-3′，产物长度90 bp。

四、统计学方法

结 果

一、3组小鼠体质量和血糖水平比较

喂养第8周末，小鼠体质量HFD+Saline组为(37.327±0.296)g，正常组为(31.765±0.235)g，HFD+GO-CoA-Tat组(33.125±0.153)g，差异有统计学意义(F=26.43，P=0.009)。在喂养第8周末检测各组小鼠空腹血糖水平，HFD+Saline组为(6.370±0.296)mmol/L，正常组为(2.867±0.299)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat组为(4.103±0.184)mmol/L，差异有统计学意义(F=44.96，P=0.021)。组间两两比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

二、3组小鼠肝细胞内和血脂水平比较

各组小鼠肝细胞内三酰甘油水平，HFD+Saline组为(101.332±2.052)mmol/L，正常组为(54.373±0.9694)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat组为(75.602±1.487)mmol/L，差异有统计学意义(F=224.7，P=0.023)。HFD+Saline组TG及TC分别为(1.943±0.136)、(5.013±0.369)mmol/L，正常组分别为(0.660±0.709)、(1.763±0.293)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat组分别为(1.237±0.071)、(2.403±0.151)mmol/L，差异均有统计学意义(F值分别为43.30和36.29，P值分别为0.023和0.031)。组间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

三、3组小鼠炎性指标比较

HFD+Saline组ALT及AST分别为(54.901±5.201)、(173.321±13.971)U/L，正常组分别为(27.914±2.401)、(96.473±3.491)U/L，HFD+GO-CoA-Tat组分别为(37.862±2.425)、(122.932±6.907)U/L，差异均有统计学意义(F值分别为14.44和17.91，P值分别为0.029和0.015)。HFD+Saline组TNF-α和IL-6分别为(2.740±0.140)、(2.980±0.070)，正常组分别为(1.000±0.070)、(1.000±0.040)，HFD+GO-CoA-Tat组分别为(1.730±0.040)、(1.630±0.040)，差异均有统计学意义(F值分别为89.12和68.34，P值分别为0.021和0.034)。组间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

讨 论

NAFLD发病机制目前仍不明确，可能与冠心病的危险因素密切相关，如血脂异常、糖尿病和代谢综合征等[13, 14]。

肥胖症和糖耐量异常在NAFLD的发病机制中起着关键作用。“多重打击”学说认为初次打击为糖耐量异常，导致肝细胞内大量脂肪聚集，引起肝细胞脂肪变性[15, 16]。本研究发现，腹腔内注射GO-CoA-Tat可降低HFD小鼠的体质量增加并维持血糖稳定。GO-CoA-Tat能显著抑制肝细胞及小鼠体内GOAT表达，在野生型小鼠中GO-CoA-Tat能控制体质量增加、改善血糖水平和调节食欲[10]。本研究结果显示，GO-CoA-Tat能显著缓解小鼠肝脏脂肪变性，并能减少肝细胞内脂质积聚。HFD+GO-CoA-Tat组TG及TC较HFD+Saline组有明显下降，提示GO-CoA-Tat能有效降低小鼠血脂浓度。Ghrelin-GOAT系统可能胰岛素抵抗、脂代谢调节过程发挥作用，而后两者均参与了NAFLD病理的发生及进展[8, 9]。本研究显示GO-CoA-Tat可能在减轻NAFLD的脂肪变性以及改善血糖方面发挥作用。

炎症性肝损伤是非酒精性肝脂肪变向非酒精性脂肪性肝炎进展的重要因素。肝细胞内大量脂肪聚集，导致氧化应激、炎症因子激活及肝细胞线粒体障碍，从而导致肝细胞炎症、纤维化等发生[17]。GO-CoA-Tat干预后HFD小鼠血清肝功能指标水平有效降低，表明GO-CoA-Tat可缓解小鼠肝脏炎症损伤，其作用可能源于潜在的对肝脏直接抗炎作用以及改善高脂肪饮食所致的代谢异常。

总之，GO-CoA-Tat可减轻小鼠的肝脂肪变性及炎症反应，为将来更进一步的药理学研究和治疗药物提供更多选择。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。