增施生物有机肥对烤烟光合特性及根际土壤微生物的影响

苏煜， 黄劭理

（1.湖南农业大学农学院，长沙 410128；2.广西中烟工业有限责任公司，南宁 530001）

烤烟为叶用经济作物，其烟叶品质的优劣直接决定了经济效益的高低，因此应给予烟叶生长所需的充足养分。化学肥料虽释效快，但养分易流失，长期大量施用会引发水质污染、土壤酸化板结和土传病害等生态问题［1-3］，继而对烟叶产量和品质产生不利影响。有机肥不仅能有效改良土壤肥力、活化土壤养分、提高土壤相关酶活力、克服土壤连作障碍，还可降低土传病害的发生［4-6］。化肥与生物有机肥的合理配施能够有效培肥土壤，协调烟叶化学成分，改良品质［7］，弥补施用单一肥料的缺陷。大量研究报道了生物有机肥对烤烟根际土壤微生物的影响：张云伟等［8］研究表明，增施生物有机肥能提高烤烟根际土壤微生物数量和碳源利用强度，明显改变烤烟根际微生物的群落功能；赵兰凤等［9］认为，生物有机肥可以增加根际土壤微生物活性；黄玥［10］研究也表明，生物有机肥可以增加烤烟根际细菌和放线菌的数量，但对真菌无显著影响。有关生物有机肥和化肥配施的研究大多集中于对根际微生物的影响，而对烤烟叶片光合特性的研究鲜见报道。为此，本研究从烤烟的光合特性、土壤根际微生物数量和群落多样性的角度进行分析，探究施用不同配比生物有机肥对烟叶光合特性和根际土壤微生物的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019年1—7月在湖南农业大学中南烟草试验站进行。土壤为沙质壤土，前茬作物为水稻，土壤基本理化性状为：有机质 21.85 g·kg−1、碱解氮 126 mg·kg−1、速效磷 27.48 mg·kg−1、速效钾 115.32 mg·kg−1、pH 6.2。供试品种为湘烟3号。化肥为烟草专用复合肥，N、P2O5、K2O含量分别为14%、16%、15%，总养分≥45%。生物有机肥由湖南百田新型肥料化工有限公司提供，以动物粪便和植物秸秆为主要原料，含CSP3复合有益活性促生菌、内合枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌等高效有益活性菌，其中，N、P2O5和K2O含量分别为0.8%、1%和4%，N-P2O5-K2O含量≥5%，有机质含量≥45%，有益活菌数≥0.2亿·g−1，氨基酸含量≥10%，腐植酸含量≥10%。

1.2 试验设计

采用随机区组设计，设置常规化肥处理（100%化肥，CK）、T1 处理（90%化肥+1 500 kg·hm−2生物有机肥）、T2处理（80%化肥+3 000 kg·hm−2生物有机肥）、T3处理（70%化肥+4 500 kg·hm−2生物有机肥）共4个处理。CK施氮量按120 kg·hm−2施入，T1、T2和T3处理化肥施氮量分别按108 kg·hm−2、96 kg·hm−2和 84 kg·hm−2施入。各处理均按照基肥∶追肥为6∶4施入，总养分比为N∶P2O5∶K2O＝1∶1∶2.4。生物有机肥作基肥全施，N和K2O不足部分用硫酸铵和硫酸钾补齐。每个处理3次重复，共12个小区。每个小区植烟50株，株行距为0.5 m×1.2 m，小区面积30 m2。田间管理按当地常规栽培措施进行。

1.3 取样与指标测定

在烤烟旺长期（移栽后60 d）测定光合速率，选择在天气晴朗的上午11：00，采用Li-6400便携式光合作用测定仪（美国LI-COR公司生产）从底部叶往上数选取烟株的第8片叶测定烟叶的净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（stomataconductance，Gs）、胞 间 CO2浓 度（intercellular CO2concentration，Ci）和 蒸 腾 速 率（transpiration rate，Tr）；用便携式SPAD仪（北京海天友诚科技有限公司生产）测定同一片烟叶的叶绿素SPAD值。同期（移栽后60 d），采用五点取样法从每个小区选取5株生长较一致的烟株，通过抖土法采集根系土样，用于测定根际土壤微生物数量和碳代谢特征。采用稀释平板计数法对细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）、真菌（马丁式培养基）和放线菌（高氏一号培养基）的数量和多样性进行分析［11］。不同碳源利用能力及代谢特征的测定采用BIOLOG ECO微平板法［12］，具体步骤如下：称取5 g土样置于高压灭菌的三角瓶中，加入0.85%氯化钠100 mL，封口，120 r·min−1振荡30 min，冰浴中静置2 min，取5 mL上清液至100 mL灭菌三角瓶中，加入45 mL无菌水，重复稀释3次，制得1∶1 000的提取液，立即用于ELISA反应。将BIOLOG ECO平板预热到25℃，用移液器取150µL提取液于各孔中，28℃恒温培养，分别在0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 用BIOLOG 读板仪测定吸光值（590 nm）［13］。用BIOLOG ECO平板每孔颜色平均变化率（average well color development，AWCD）来表征土壤微生物对碳源的利用能力［14］。

1.4 数据处理

采用Excel 2007进行数据整理和分析，用SPSS 17.0进行显著性分析，用DPS数据处理系统进行主成分分析及灰色关联度分析。

2 结果与分析

2.1 增施生物有机肥对烤烟光合特性的影响

叶绿素含量是衡量植物衰老程度的重要参数，与植物光合作用的进行密切相关。旺长期由于烟株体内代谢旺盛，养分利用率高，促进了叶绿素的合成。增施生物有机肥处理的烟叶SPAD值均显著高于对照，且生物有机肥配比越高，变化越明显（表1）。净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Ci）的变化趋势较一致，各参数均呈现出随生物有机肥配施量的增加而增大的趋势（表1）。王通明等［15］认为，有机肥的施用能延缓烟株的衰老，提高烟叶合成淀粉的能力和叶片光能利用率。生物有机肥中含有丰富的有机质和诸多有益菌种，能够有效延缓叶绿素的降解速率，使得烟株的碳代谢强度得以增强，从而为叶绿素的生物合成提供更多的碳骨架和能量。

表1 不同生物有机肥处理下烤烟的光合特性Table 1 Photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco with different treatment of bio-organic fertilizer

2.2 生物有机肥对烤烟根际土壤微生态的影响

2.2.1 生物有机肥对微生物数量的影响 细菌、真菌、放线菌是土壤微生物中的主要菌类，具有氧化、硝化、氨化、固氮和硫化等功能，在土壤有机物质的分解转化过程中起主导作用［16］。表2表明，生物有机肥用量的增加促进了细菌、真菌和放线菌数量的增加，总体微生物数量呈现细菌＞放线菌＞真菌。各处理间的细菌数量存在显著差异，表现为T3＞T2＞T1＞CK。相较于CK，T2和T3处理的真菌数量分别增长了15.6%和16.8%，但T1与CK处理间差异不显著。施用生物有机肥显著提高了根际放线菌数量，相较于CK，T1、T2和T3处理的放线菌数量分别增加了33.9%、72.4%和86.2%，表明施用生物有机肥有益于微生物的生长和繁殖，提升了根际土壤微生物的密度。

表2 不同生物有机肥用量下土壤微生物的数量Table 2 The amount of microorganism in soil with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.2 生物有机肥对土壤微生物碳代谢指纹的影响 碳源AWCD是单一碳源利用能力的重要参数，反映了土壤微生物活性，AWCD值与碳源利用能力呈正相关［17-18］。图1表明，0～24 h内土壤微生物活性较低；24～72 h区间内微生物活性急速上升，碳源利用力增强；72～144 h内，土壤微生物对碳源的利用能力仍在提升但增速逐渐放缓；144 h以后，AWCD值趋于平稳。AWCD值随培养时间的延长而逐渐增大，表明土壤微生物对31种碳源利用能力在不断增强，且不同处理AWCD值差异显著，配施生物有机肥处理的AWCD值明显高于CK处理。在生物有机肥的作用下，根际微生物活性增强，碳源利用强度和程度均得到提高。

图1 不同生物有机肥用量下烤烟根际土壤微生物AWCD值动态变化Fig.1 AWCD value dynamics over incubation time in the rhizosphere of flue-cured tobacco with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.3 生物有机肥对微生物不同种类碳源利用强度的影响 将31种碳源分为糖类、氨基酸类、聚合类、酚类、胺类和羧酸类共6大类，不同施肥处理下土壤微生物对各类碳源的利用偏好存在差异。相较于CK，配施生物有机肥能够不同程度地提高各类碳源的利用能力（图2）。T3处理中，微生物对各类碳源的利用率皆高于其他处理，其中对糖类碳源的利用率较CK提高了291%。但T1、T2和T3处理间，生物有机肥施用量的差异并未对胺类碳源利用率的提升起到明显作用；氨基酸类、酚类和羧酸类碳源的利用能力在T2和T3处理间也无显著差异。由此表明，增施生物有机肥，碳源利用能力得到提高，达到一定值后，生物有机肥用量与碳源利用率的相关性降低，碳源利用力趋于稳定。

图2 根际土壤微生物对不同种类碳源的利用能力Fig.2 Utility for different types of carbon sources by rhizospheric microbes in soil with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.4 不同碳源主成分分析 为探究配施不同用量的生物有机肥处理下土壤微生物群落对31种单一碳源的利用，提取4个主成分因子（表3），主成分1（PC1）可以解释碳源利用64.705%的变异；主成分2（PC2）可以解释14.544%；前两个主成分的累计贡献率达到79.249%。主成分3（PC3）和主成分4（PC4）的方差贡献率较小，分别为9.996%和4.105%。

表3 主成分贡献率Table 3 Contribution rate of principal component

PC1和PC2分析结果（表4）表明，对PC1贡献较大的碳源有27个（载荷值＞0.6），羧酸类占22.58%、糖类占19.35%、氨基酸类占19.35%、聚合类占12.90%、酚类和胺类各占6.45%。糖类碳源中D-甘露醇、氨基酸类中L-天冬酰胺酸和羧酸类α-丁酮酸对PC1的载荷值较高；与PC2相关性较高的2个碳源（载荷值＞0.6）分别为糖类中的β-甲基 D-葡萄糖苷和 D，L-α-甘油。除 D，L-α-甘油和α-D-乳糖外，其他碳源与PC1的相关性皆高于PC2。

表4 主成分载荷值Table 4 Loading values of principal components

2.2.5 微生物群落多样性分析 根据根际微生物AWCD动态变化和碳源利用总能力情况，选取144 h的平均吸光度数值来分析不同生物有机肥施用量下土壤微生物群落的多样性差异。结果（表5）表明，Shannon丰富度指数、Simpson优势度指数和McIntosh均匀度指数在生物有机肥处理下均有所升高，总体表现为T3＞T2＞T1＞CK，各生物有机肥处理与CK处理间均存在显著差异。而T1、T2、T3处理间，Shannon和Simpson指数差异不显著，表明生物有机肥的施用量对群落丰富度和优势度的提升无显著影响。

表5 土壤微生物群落多样性Table 5 The diversity of microbial community in soil

2.3 烤烟光合特性与土壤微生物部分参数关联度分析

通过灰色关联度分析，对施用生物有机肥下微生物与光合特征指数、微生物多样性及碳源利用程度的关联性进行探究，结果（表6）表明，与光合特性的表征参数叶绿素SPAD值、净光合速率（Pn）以及微生物丰富度和优势度指数的关联性表现为细菌＞放线菌＞真菌＞生物有机肥；与微生物均匀度和碳源利用能力关联程度较大的参数是放线菌，关联度较小的参数是生物有机肥。相较于生物有机肥，根际微生物与烤烟叶片光合性能、土壤微生物群落多样性和碳源利用能力的关联性更强。

表6 光合参数与土壤微生物多样性的关联度Table 6 Correlation between photosynthetic parameters and soil microbial diversity

3 讨论

相较于单施化肥，配施生物有机肥后，烤烟叶片的光合能力增强，根际土壤微生物的菌群密度和活跃率增加，与张云伟等［20］的研究结果一致；土壤微生物的均匀度、优势度及群落丰度均得到提高，但生物有机肥的施用量对土壤微生物的多样性无显著影响。综合各性状的表现，70%化肥配施4 500 kg·hm−2生物有机肥处理效果最佳。

生物有机肥中含有大量的益菌群和有机质，外源有益菌种和活性碳源的介入丰富了土壤中可利用的养分，在一定程度上活化了土壤微生物，同时也加剧了微生物间的营养竞争。相较于生物有机肥，根际微生物数量与烟叶中叶绿素SPAD值和光合速率的关联性更强，有研究表明微生物对植株叶绿素荧光参数和有效光的利用产生提高效应［21-23］，由此说明微生物对烟叶光合性能的改善起到一定的调节作用。微生物中细菌对生物有机肥的增施最为敏感，这可能与供试肥料中主要功能菌为芽孢杆菌类细菌有关。枯草芽孢杆菌等有益微生物能利用土壤中的有机质，产生大量生长素和赤霉素等次级代谢物，促进了烤烟的生长发育，从而实现微观效应向表观参数优化的转变。且外源介入的细菌与本土细菌形成了共生增殖的关系，对土壤营养物的转化、供应能力及土壤肥力产生不同程度的影响。