一株堆肥高效解磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性

詹亚斌， 张磊， 丁晓艳， 马恬恬， 魏雨泉*， 李季

(1.中国农业大学资源与环境学院， 北京 100193； 2.中国农业大学有机循环研究院(苏州)， 苏州 215100)

磷是植物生长必需的三大元素之一[1]，中国74%以上的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷为无效形式。为避免磷素缺乏对粮食增产的制约，每年大量磷肥会施入耕地；但大部分磷进入土壤后，易与Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等结合形成难溶性磷，降低了磷肥的磷素植物可利用性，导致作物当季利用率较低(5%～10%)；大量施磷还会导致磷素在土壤中富集，并向水体中迁移，造成水体富营养化。因此，如何提高磷肥的磷素有效性，是农业生产中亟待解决的问题[2-4]。

常用的化学磷肥(磷酸铵、过磷酸钙)大都是通过磷矿粉加工制作而成，制作成本较高且溶解率较低。许多科研工作者在有机废弃物堆肥过程中添加磷矿粉，期望通过堆肥过程有机物分解和微生物分泌的有机酸，活化难溶性无机磷，增加堆肥产品的速效磷含量[5]。由于解磷微生物可活化难溶性磷，目前，已有大量报道将解磷菌接种于堆肥，以进一步强化堆肥磷素转化；但是大部分是从土壤中筛选获得解磷菌，扩大培养后接种至堆肥中[6-10]；土壤中筛选获得的解磷菌，可能并不适应堆肥生态环境。为了进一步提升解磷菌剂的适应性及其生物安全性，应优先考虑从堆肥中筛选获得高效解磷菌株，将其制备为解磷菌剂，并应用于堆肥中。

从鸡粪堆肥中筛选高效解磷菌株，通过16S rDNA进行菌种鉴定，并研究不同碳源、氮源、初始pH、难溶性磷种类、难溶性磷添加量、可溶性磷浓度对菌株溶磷效果的影响。以期为有机废弃物堆肥提供解磷菌种资源，从而提高有机废弃物堆肥化产品附加值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

筛菌样品：取鸡粪好氧堆肥腐熟物料500 g，放入无菌塑料袋中，封口，即刻带回实验室4 ℃保存，用于解磷菌株的筛选。

供试磷源：磷酸三钙 Ca3(PO4)2(分析纯，P质量分数20.00%)；磷酸铁 FePO4·H2O (分析纯，P质量分数16.60%)；磷酸铝 AlPO4(分析纯，P质量分数25.00%)。

1.1.2 培养基

(1)国家植物研究所磷酸盐培养基(National Botanical Research Institute’s phosphate growth medium，简称“NBRIY培养基”)葡萄糖10.00 g，CaCl22.22 g，(NH4)2SO40.50 g，MgSO40.10 g，FeSO40.002 g，MnSO40.002 g，KCl 0.20 g，NaCl 0.20 g，Ca3(PO4)25.00 g，琼脂15.00 g，1% 溴甲酚紫2 mL，蒸馏水1×103mL，调节pH至7.0；主要用于解磷菌的筛选；固体培养基添加20.00 g琼脂粉。

(2)蒙金娜液体培养基(Pikovskaya’s medium，简称“PVK培养基”)：葡萄糖10.00 g，(NH4)2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，蒸馏水1×103mL，分装到摇瓶中，每瓶液体100 mL、Ca3(PO4)25.00 g，调节pH至7.0；主要作为无机磷基础液体培养基，进行解磷菌的研究。

(3)溶菌肉汤液体培养基(Luria-Bertani；以下简称“LB培养基”)：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，蒸馏水1×103mL，调节pH至7.0；主要用于菌株的活化和保存。

(4)LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加20.00 g琼脂粉；主要用于菌株培养及形态观察。

1.2 试验方法

1.2.1 解磷菌株的初筛、复筛

(1)初筛。称取采集到的新鲜样品10 g，置于250 mL三角瓶中，倒入0.85% NaCl 90 mL，将三角瓶放入30 ℃、180 r/min条件下培养30 min，进行10倍系列梯度稀释，分别取稀释到10-3、10-4、10-5样品溶液100 μL，均匀涂步到改良NBRIY培养基中，恒温培养6 d。挑选生长良好，使培养基由蓝色变为黄色、D/d(D为透明圈直径，d为菌落直径)较大的菌落，于LB固体培养基中纯化后，置于4 ℃保存。

(2)复筛。将初筛的菌株接种于LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养24 h，稀释菌株的OD600为1；按照1%接种至PVK液体培养基中，调节pH至7.0，30 ℃、180 r/min条件下培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量，最终确定高效稳定的解磷菌株。

1.2.2 解磷菌株的分子鉴定

采用煮沸法获取高效解磷菌株的DNA，16S rDNA(27F: 5′-AGA GTTTGATC-CTGGCTCAG-3′和1492 R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)的保守型序列为引物进行扩增，扩增产物纯化回收后，送生工生物(上海)股份有限公司测序。测序结果在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中进行比对(BLAST)分析，并通过软件MEGA 6.0构建系统发育树[18]。

1.2.3 菌株溶磷能力的测定

(1)不同碳源对菌株溶磷效果的影响。以PVK培养基为基础，分别以葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、纤维素、可溶性淀粉为碳源，其中葡萄糖、半乳糖的添加量为10.0 g/L，蔗糖、乳糖的添加量为9.5 g/L，纤维素、可溶性淀粉的添加量为9.0 g/L(保证每个处理中C含量一致)。调节pH至7.0，接种量1%，不接种的作为对照(CK)，30 ℃，180 r/min培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量、pH。

(2)不同氮源对菌株溶磷效果的影响。以PVK培养基为基础，分别添加0.50 g (NH4)2SO4、0.41 g NH4Cl、0.23 g CO(NH2)2为氮源，调节pH至7.0，接种量1%，不接种的作为CK，30 ℃、180 r/min培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量、pH。

(3)不同初始pH对菌株溶磷效果的影响。以PVK培养基为基础，调节pH至4、5、6、7，接种量1%，不接种的作为CK，30 ℃、180 r/min培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量、pH。

(4)不同难溶性磷源(磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝)对菌株溶磷效果的影响。以PVK培养基为基础，分别以6.02 g FePO4(分析纯)、4.0 g AlPO4(分析纯)替换5.0 g Ca3(PO4)2(等P含量)，调节pH至7.0，接种量1%，不接种的作为CK，30 ℃、180 r/min培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量、pH。

(5)难溶性磷浓度对菌株溶磷效果及生物量的影响。以PVK培养基为基础，难溶性磷为磷酸钙，Ca3(PO4)2添加量分别为2.5、5.0、7.5 g，调节pH至7.0，接种量1%，不接种的作为CK，30 ℃、180 r/min培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量、pH、生物量(OD600)。

(6)可溶性磷浓度对菌株溶磷效果及生物量的影响。以PVK培养基为基础，向培养基中加入磷浓度为0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mmol/L的KH2PO4/K2HPO4缓冲液(平衡磷酸盐自身酸碱度对pH的影响)，调节pH至7.0，接种量1%，不接种的作为CK，30 ℃、180 r/min培养6 d，测定溶液中水溶性磷含量、pH、生物量(OD600)。

1.2.4 测定方法

向上述剩余的发酵液中加入2 mL H2O2，振荡后，160 ℃灭菌120 min，以充分破坏菌体，释放出微生物量磷，5×103r/min离心取上清液，采用钼锑抗比色法[19]测定解磷总量；pH采用台式pH计测定[12]。

溶磷量=溶液最终可溶性磷质量-溶液初始可溶性磷质量。

溶磷效率=溶磷量/溶液总磷质量×100%。

1.2.5 数据统计分析

利用SPSS、ORIGIN、MEGA对数据进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 解磷菌的初筛、复筛

(1)初筛：在改良NBRIY培养基平板上，30 ℃恒温培养6 d后，发现有35株菌可以在平板上生长，使培养基由蓝色变为黄色、具有明显溶磷圈的菌落7株。其中，PSB6的D/d最大，为3.32；其余处理的D/d为1.52～2.45。

(2)复筛：研究发现PSB6溶磷能力最强，为126.37 mg/L；其余处理的溶磷量为50.12～99.56 mg/L(均小于100.00 mg/L)。

表1 解磷菌的筛选结果

2.2 分子生物学鉴定

对解磷菌株PSB6的16S rDNA基因片段进行PCR扩增，最终获得长度约为1.5×103bp的基因序列，与NCBI数据库中的已知序列进行BLAST比对分析发现，该菌株与Bacillus_sp_hb90的序列相似度达到99%，将PSB 6初步归于Bacillus_sp。将PSB6的基因序列提交至NCBI中的GenBank，获得登录号MW513386。根据结果构建菌株PSB 6的系统发育分析如图1所示。

图1 菌株PSB6的系统发育树

2.3 菌株溶磷能力研究

2.3.1 碳源

不同碳源对菌株解磷能力有明显的影响(图2)。葡萄糖和半乳糖有利于菌株解磷，溶磷量分别为123.3、111.6 mg/L；淀粉次之，溶磷量为54.8 mg/L；蔗糖、乳糖、纤维素的溶磷量最低。葡萄糖和半乳糖的发酵液pH分别为6.26和6.31(均小于6.5)；淀粉的pH较高(6.91)；蔗糖、乳糖、纤维素的发酵液的pH分别为7.62、7.82、8.41(均大于7.5)；说明整体上产酸能力越强，溶磷量会越大。根据以上结果，可知，菌株PSB6解磷的最适碳源为葡萄糖和半乳糖。

图2 碳源对PSB6溶磷效果的影响

2.3.2 氮源

不同氮源对菌株的解磷能力影响不同(图3)。以硫酸铵、氯化铵、尿素为氮源下PSB6的溶磷量分别为133.6、92.3、61.8 mg/L，培养液最终pH分别为6.08、6.15、7.43，研究结果表明，产酸能力越强，溶磷能力越大；菌株PSB6的最适溶磷N源为硫酸铵。

图3 氮源对PSB6溶磷效果的影响

2.3.3 初始pH

不同初始pH对菌株解磷能力影响不同(图4)。随着初始pH的增大(4～8)，4个处理的溶磷量呈现先上升后下降的趋势。4个处理(pH为5、6、7、8)的溶磷量分别为53.5、111.2、126.37、90.3 mg/L，溶磷能力最强的是初始pH为7.0的处理，溶磷能力最弱的是初始pH为5.0的处理；可能是初始pH低的处理，不利于菌株PSB6的生长，从而不利于难溶性磷的溶解。培养第6天，4个处理的pH分别为6.12、6.23、6.37、6.48；可能是菌株产酸，使培养液的pH呈现弱酸性(6.5以下)。

图4 初始pH对PSB6溶磷效果的影响

2.3.4 难溶性磷种类

解磷菌PSB6对不同难溶性磷的解磷效果不同(图5)，溶磷量从大到小排序为磷酸三钙(125.6 mg/L)>磷酸铝(35.3 mg/L)>磷酸铁(9.6 mg/L)。3个处理的pH从小到大排序为磷酸三钙(6.12)<磷酸铝(6.50)<磷酸铁(6.76)。说明虽然PSB6对不同难溶性磷都有解磷效果，但与磷酸铝、磷酸铁相比，对磷酸钙的活化效果最强。

图5 难溶性磷种类对PSB6溶磷效果的影响

2.3.5 难溶性磷添加量

难溶性磷(磷酸三钙)含量会影响菌株的溶磷效果(图6)。随着磷酸三钙含量增加，菌株PSB6的溶磷量逐渐降低；3个处理的溶磷量分别为170.5、125.6、80.3 mg/L，溶磷效率分别为34.10%、12.56%、5.35%；说明添加低含量(2.5 g/L)的磷酸钙有利于菌株对难溶性磷的溶解，而高含量的难溶性磷含量(5.0、7.5 g/L)会抑制难溶性磷的溶解。3个处理的pH分别为6.07、6.18、6.33，说明添加磷酸钙含量低(2.5 g/L)的处理有利于微生物的生长、产酸，从而有利于磷酸三钙中难溶性磷的溶解。随着磷酸三钙含量的增加，菌株PSB6的OD600逐渐降低(与溶磷效率变化规律一致)，3个处理的OD600分别为0.65、0.55、0.49：说明难溶性磷含量低的处理溶磷量大，促进了PSB6的生长。

图6 初始难溶性磷含量对PSB6溶磷效果的影响

2.3.6 可溶性磷浓度

可溶性磷浓度会影响影响菌株的溶磷效果(图7)。随着可溶性磷浓度的增加，菌株PSB6的溶磷量呈现先上升后下降的趋势。当发酵液中的可溶性磷浓度为0、0.5、1、5 mmol/L时，溶磷量为115.4、126.37、200.2、173.6 mg/L(均>100 mg/L)；当发酵液的可溶性磷浓度为10～20 mmol/L时，菌株PSB6不发挥解磷效果；说明当环境中的可溶性磷浓度达到10 mmol/L以上时，满足了菌株PSB6生长所需的可溶性磷浓度；此时，不会激发PSB6对难溶性磷的溶解。随着可溶性磷浓度的增加，菌株PSB6的OD600呈现先上升后下降的趋势。培养第6天，6个处理的OD600分别为0.56、0.63、0.71、0.76、0.03、0.02。当可溶性磷浓度为1、5 mmol/L时，PSB6的生物量较大，OD600分别为0.71和0.76；说明环境中存在一定量可溶性磷，会促进解磷菌株PSB6的生长。当可溶性磷浓度为10、20 mmol/L时，PSB6的生物量较小，OD600分别为0.03、0.02；说明环境中的可溶性磷达到一定的浓度(>10 mmol/L)，会抑制菌株PSB6的生长，不会激发解磷菌对难溶性磷的溶解。

图7 初始可溶性磷浓度对PSB6溶磷效果的影响

3 讨论

碳源、氮源、初始pH、难溶性磷种类及含量会影响解磷微生物的生长代谢，从而影响难溶性磷的溶解。PSB6的最适碳源、氮源分别为葡萄糖和硫酸铵；这与郑喜清等[14]的研究结果一致。王莉晶等[20]筛选获得一株解磷菌最适解磷碳源为蔗糖；贺梦醒等[21]筛选获得一株解磷最适解磷碳源为淀粉。不同解磷菌株的生长所需的最初始pH有所不同，pH过高或过低均会影响菌株的解磷能力。Xiao等[22]筛选获得一株菌，最适解磷初始pH为6.0；郑肖兰等[23]筛选获得一株菌最适解磷初始pH为8.0；高桂凤等[15]筛选获得一株菌，最适解磷初始pH为9.0；而本研究筛选获得的PSB6最适解磷初始pH为7.0。当难溶性磷源为磷酸三钙时，菌株PSB6的溶磷效果最好；这与李豆豆等[12]的研究结果一致。当培养液中可溶性磷浓度较低(0～5 mmol/L)时，PSB6具有较强的溶磷效果；当培养液中可溶性磷浓度较高(≥10 mmol/L)时，PSB6几乎不溶解难溶性磷；可能是，培养液中的可溶性磷可以满足解磷菌株的PSB6的生长，不会激发解磷菌对难溶性磷的溶解；这里面存在的机制需要作进一步研究。

在后续的研究中，可以将本研究中筛选获得的解磷菌PSB6，接种至堆肥中进行溶磷效果的验证。若将PSB6接种至含有难溶性磷的堆肥中，可以尝试往堆体中添加葡萄糖作为碳源、硫酸铵作为氮源，并且调节堆体pH至7.0；若堆体中需要添加难溶性磷，建议添加质量分数2.5‰的磷酸三钙，以便最大限度地促进PSB6对难溶性磷的溶解。这对餐厨、污泥、畜禽粪便等有机废弃物的资源化(堆肥)处理是极其有意义的[24-25]。

4 结论

(1)从鸡粪堆肥物料中筛选获得一株解磷细菌，命名为SPB6，根据形态观察和16S rDNA序列比对，将该菌株归属于Bacillus_sp。

(2)在最适C源为葡萄糖、最适N源为硫酸铵、最适初始pH为7.0的条件下，PSB6的溶磷量为126.37 mg/L。

(3)PSB6的最适溶磷的难溶性磷为磷酸三钙；当磷酸三钙为2.5 g/L时，具有最大溶磷量170.5 mg/L。

(4)PSB6的最适溶磷的可溶性磷浓度为1 mmol，溶磷量为200.2 mg/L；当可溶性磷浓度超过10 mmol/L时，菌株PSB6不发挥解磷效果。

(5)若将PSB6应用于好氧堆肥中，建议往堆体中添加部分葡萄糖和硫酸铵、0.25%的磷酸三钙，以期促进堆体Olsen-P含量。