香青兰总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激和线粒体的保护作用

李 闯， 马晓莉， 文志萍， 陈卫军， 袁 勇， 王新春， 曹文疆

(1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2.石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)严重制约着心血管疾病患者的救治成功率。目前仍然没有非常有效的措施避免因再灌注而引起的心肌损伤[1-3]。因此，对MIRI的发病机理以及预防药物的研究已经成为近年来医药工作者的重大研究课题之一。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)信号通路与氧化应激和线粒体保护密切相关。缺血再灌注时，线粒体内活性氧(ROS)爆发并累积，大量的ROS损伤线粒体内外膜及周围大分子物质，使线粒体结构和功能紊乱，造成氧化应激损伤，从而使AMPK被激活[4-7]。活化后的AMPK通过增强分解代谢，抑制合成代谢，缓解能量应激状态[8-9]。PGC-1α作为其下游蛋白分子，参与氧化应激、能量代谢、细胞凋亡、细胞自噬等[10-11]。激活后的AMPK和SIRT1分别通过磷酸化作用和去乙酰化作用直接或间接影响PGC-1α的活性，PGC-1α是线粒体生物合成和氧化代谢过程中主要的调节因子[12-13]，通过调控线粒体氧化应激相关蛋白表达，参与调节线粒体生物合成、能量代谢以及氧化应激，在改善线粒体结构及功能中发挥重要的作用[14-15]。

香青兰总黄酮是提取自新疆特色资源植物药香青兰中的一类天然黄酮类活性成分。课题组前期研究表明，香青兰总黄酮对MIRI大鼠线粒体具有保护作用[16-19]。其机制是否与调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号转导通路有关尚不明确。因此，本文通过研究香青兰总黄酮预处理对MIRI大鼠的氧化应激和线粒体保护作用的相关机制，为香青兰总黄酮防治MIRI提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠，体质量220～270 g，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，动物使用许可证号SYXK(新)2016-0001。操作均符合实验动物伦理标准。

1.2 试剂与药物 香青兰总黄酮提取物(由新疆药物研究所提供，纯度57%，批号20141008)。TTC(北京索莱宝科技有限公司，批号531D036)；乌拉坦麻醉药(武汉远城科技发展有限公司，批号 20151106)；Compound C(货号S7840)、EX-527(货号S1541)均购自美国Selleck公司；活性氧(ROS)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Anti-AMPKα1+α2 (货号ab131512)、Anti-AMPK phospho α1+α2 (货号ab23875)、Anti-SIRT1 (货号ab110304)、Anti-PGC-1α (货号ab191838)均购自英国Abcam公司。

1.3 仪器 Pico-17台式低温离心机、Varioskan Flash 3001多功能酶标测定仪(美国Thermo Scientific公司)；HX-300呼吸装置(成都泰盟软件有限公司)；-80 ℃冰箱(青岛海尔股份有限公司)；EOL-JEM-1230透射电子显微镜(日本JEOL公司)；EM-UC6超薄型切片机(德国Leica公司)；脱色摇床仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；恒温电热培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 分组及给药 50只雄性SD大鼠，随机分为5组，分别为假手术组，生理盐水灌胃；模型组，生理盐水灌胃；香青兰总黄酮组，每天灌胃60 mg/kg香青兰总黄酮；香青兰总黄酮+AMPK抑制剂Compound C组，每天灌胃60 mg/kg香青兰总黄酮，再在灌注前20 min尾静脉注射250 μg/kg Compound C；香青兰总黄酮+SIRT1抑制剂EX-527组，每天灌胃60 mg/kg香青兰总黄酮，再于灌注前20 min腹腔注射5 mg/kg EX-527，连续7 d，给药结束后建立MIRI模型。

2.2 建模及取材 25%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于恒温加热板，胸部脱毛，气管插管，开胸，呼吸机连接。暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，结扎完成后心脏复位。缺血30 min后剪断结扎线，再灌注120 min，迅速剪取心脏，置于冰生理盐水中，清洗心脏，于-80 ℃冰箱中保存。假手术组同法操作，但不进行结扎。

2.3 大鼠心肌梗死程度检测 1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyte-trazolium chloride，TTC)染色法检测心肌梗死面积。各组大鼠心脏于-20 ℃速冻30 min后，切成等厚度的5片薄片，放入1% TTC染液中，37 ℃恒温水浴避光染色30 min，PBS冲洗切片3次，10%甲醛固定切片12 h，梗死心肌是TTC着色部分，呈灰白色；TTC不着色部分是正常心肌，呈砖红色。采集图像，Image J软件处理。心肌梗死面积=(梗死面积之和/全心面积)×100%。

2.4 大鼠心肌组织ROS水平检测 采用ROS检测试剂盒。DCFH-DA活性氧检测探针自身没有荧光，在细胞内被水解为DCFH，再被氧化为不能通过细胞膜的强绿色荧光物质DCF，在激发波长502 nm、发射波长530 nm左右有最大吸收峰，以荧光度值/mg蛋白(a.u./mgpro)表示结果。

2.5 大鼠血清SOD活性、MDA水平检测 按照相关试剂盒说明书步骤进行操作，采用酶标仪检测吸光度，并计算SOD活性和MDA水平。

2.6 免疫组化法检测心肌组织AMPK、SIRT1及PGC-1α表达 将制好的石蜡切片常规脱蜡水化，PBS缓冲液清洗3次，每次3 min，高压修复抗原用pH 6.0枸橼酸盐缓冲液，PBS缓冲液清洗2次，每次5 min，3% H2O2孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS缓冲液清洗2次，每次5 min，滴加一抗(AMPK、SIRT1、PGC-1α稀释比例分别为1∶40、1∶50、1∶100)，4 ℃过夜后37 ℃复温30 min，PBS清洗2次，每次5 min，滴加辣根酶IgG复合物，37 ℃孵育30 min，蒸馏水清洗3次，1%盐酸酒精分化15～30 s，蒸馏水清洗3次，最后过梯度乙醇及二甲苯进行脱水，中性树胶封片，自然晾干后荧光200倍显微镜下观察。棕黄色表达即为阳性表达。胞浆表达的蛋白以灰度值表示，阳性率=IOD/area；对于核表达的蛋白，阳性表达率=阳性细胞核个数/视野中所有细胞核个数。

2.7 心肌组织线粒体超微结构观察 造模结束后，心肌组织切为1 mm×1 mm×1 mm小块，2.5%戊二醛液固定24 h以上，0.1%磷酸漂洗，1%锇酸固定1 h，磷酸缓冲液冲洗，50%、70%、80%、90%丙酮梯度脱水1 min，丙酮脱水2次，每次10 min，环氧树脂812常规包埋，37 ℃恒温箱中过夜后移到45 ℃恒温箱中12 h，60 ℃放置24 h，超薄切片，硝酸铅-醋酸双氧铀染色，JEOL-1230透射电子显微镜下观察。

3 结果

3.1 香青兰总黄酮对大鼠心肌梗死面积的影响 假手术组大鼠心肌呈砖红色，没有发生心肌梗死；与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积百分比增加(P<0.01)；与模型组比较，香青兰总黄酮组大鼠心肌梗死面积百分比降低(P<0.01)；与香青兰总黄酮组比较，香青兰总黄酮联合AMPK及SIRT1抑制剂组心肌梗死面积百分比均增加(P<0.01)，见图1。

注：A为各组大鼠TTC染色， B为各组大鼠相对心肌梗死面积。与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与香青兰总黄酮组比较，&&P<0.01。图1 香青兰总黄酮对大鼠心肌梗死面积的影响Fig.1 Effects of D. moldavica total flavonoids on myocardial infarction area in rats

3.2 香青兰总黄酮对大鼠心肌组织ROS水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织ROS水平升高(P<0.01)；与模型组比较，香青兰总黄酮组大鼠心肌ROS水平降低(P<0.01)；与香青兰总黄酮组比较，香青兰总黄酮联合AMPK及SIRT1抑制剂组ROS水平升高(P<0.01)，见表1。

表1 香青兰总黄酮对大鼠心肌组织ROS水平的影响

3.3 香青兰总黄酮对大鼠血清SOD活性和MDA水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清SOD活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；与模型组比较，香青兰总黄酮组大鼠血清SOD活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)；与香青兰总黄酮组比较，香青兰总黄酮联合AMPK抑制剂及SIRT1抑制剂组大鼠血清SOD活性降低，MDA水平升高(P<0.01)，见表2。

3.4 香青兰总黄酮对大鼠心肌组织AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达的影响 AMPK主要在细胞核表达，细胞质少量表达；SIRT1及PGC-1α在质、核都有表达，棕褐色即阳性表达。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达减少(P<0.05)；与模型组比较，香青兰总黄酮组大鼠心肌组织中AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达增加(P<0.01)；与香青兰总黄酮组比较，香青兰总黄酮联合AMPK抑制剂及SIRT1抑制剂组大鼠心肌组织中AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达减少(P<0.01)，见图2、表3。

表2 香青兰总黄酮对大鼠血清SOD活性和MDA水平的影响

图2 各组大鼠心肌组织AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达(免疫组化，×200)Fig.2 Myocardial protein expressions of AMPK, SIRT1 and PGC-1α of rats in each group(immunocytochemistry，×200)

3.5 香青兰总黄酮对大鼠心肌组织线粒体超微结构的影响 假手术组大鼠心肌组织线粒体外膜光滑，内膜褶皱呈嵴，嵴形状规则，线粒体光密度居中，线粒体双层膜结构明显，肌纤维整齐排列；模型组大鼠心肌组织线粒体嵴突紊乱、断裂甚至消失，或溶解到无正常结构，肌丝排列散而乱；香青兰总黄酮组大鼠心肌组织线粒体膜基本完整，嵴突基本完整，部分消失，少部分断裂，肌丝排列整齐，线粒体损伤程度较模型组明显减轻；香青兰总黄酮联合AMPK抑制剂及SIRT1抑制剂组大鼠心肌组织线粒体损伤程度明显高于香青兰总黄酮组，线粒体膜基本消失，嵴断裂、紊乱，肌丝松散，见图3。

表3 香青兰总黄酮对大鼠心肌组织AMPK、SIRT1、PGC-1α表达的影响

4 讨论

香青兰总黄酮对MIRI的保护作用中，心肌梗死面积是评价心肌损伤程度以及模型成功的重要指标。本研究显示，采用结扎SD大鼠左冠状动脉前降支能导致大鼠心肌梗死面积的增加，而香青兰总黄酮能降低MIRI模型大鼠心肌梗死面积，对MIRI大鼠具有明显的保护作用。但是，香青兰总黄酮联合AMPK及SIRT1抑制剂后，香青兰总黄酮对心肌的保护作用被抑制，提示AMPK和SIRT1直接或间接参与香青兰总黄酮对心肌组织的保护作用。

线粒体是心肌产能的场所，线粒体的稳态和平衡是决定心肌细胞存活的关键因素，线粒体如果肿胀、破裂和水解，会致使细胞死亡，并且受损的线粒体产生的活性氧是正常线粒体的十余倍，再灌注期ROS爆发，导致机体的氧化还原状态失衡，氧化还原状态对于机体稳态的维持起着重要的作用，尤其机体抗氧化能力的高低是抗氧化应激损伤的关键。因此，降低线粒体活性氧水平，保护线粒体超微结构损伤对机体稳态的维持起着重要的作用。本研究结果显示，与模型组比较，香青兰总黄酮组大鼠心肌组织ROS水平降低，线粒体的超微结构损伤明显得到改善；香青兰总黄酮联合AMPK及SIRT1抑制剂组大鼠心脏组织ROS水平以及线粒体的超微结构损伤均明显高于香青兰总黄酮组，说明香青兰总黄酮对心肌ROS的降低作用以及线粒体的保护作用均被抑制剂所抵消。表明AMPK和SIRT1参与香青兰总黄酮对心肌细胞的保护作用。

在MIRI模型中，PGC-1α通过调控下游相关蛋白的表达，进而调节线粒体氧化应激相关因子如SOD、MDA等的表达，SOD是抗氧化应激酶，MDA是脂质过氧化的产物，反映机体抗氧化能力。AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路可以通过感应机体的氧化应激状态，在心肌细胞线粒体生物合成及氧化应激中发挥重要作用。本研究结果显示，与模型组比较，香青兰总黄酮组大鼠血清中SOD活性及心肌组织AMPK、SIRT1、PGC-1α表达均增加，血清MDA水平降低；香青兰总黄酮联合AMPK及SIRT1抑制剂后，血清SOD活性及心肌组织AMPK、SIRT1、PGC-1α表达均降低，血清中MDA水平升高。提示香青兰总黄酮可以通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路对心肌细胞发挥保护作用。

综上所述，香青兰总黄酮可以减轻MIRI的心肌梗死程度，降低ROS及MDA水平，提高SOD活性，抗氧化应激损伤，改善MIRI过程中的线粒体结构损伤，而以上保护作用则均被AMPK及SIRT1抑制剂所抑制，表明香青兰总黄酮可能通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路参与心肌线粒体结构和功能以及氧化应激损伤的保护。