超声辅助提取西藏凹乳芹总黄酮工艺的优化

李 阳， 余晓晖， 郭 玫， 杜 弢*

[1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究重点实验室，甘肃 兰州 730000]

西藏凹乳芹Vicatiathibeticade Boiss.是常用藏药，也为藏药基础方五大根药之一，主要分布于我国云南西北部、四川西部、西藏等地，以西南地区最为集中[1]，其干燥根在当地民间被作为当归的替用品，也常作为营养蔬菜用于炖肉、炖鸡等, 并且鲜品还可生吃，风味独特[2]。近年来研究表明，西藏凹乳芹含有多种类型成分，如黄酮、香豆素、甾体类、酚酸等[3-5]，具有抗疲劳、抗缺氧、耐高温等生物活性，在滋补性功能的食品开发和药用价值方面具有较大的开发潜力及应用前景[6-9]。

目前，西藏凹乳芹总黄酮的提取方法大多为回流提取，而本实验采用超声辅助提取，并且采用Box-Behnken响应面法筛选最优工艺，以期为该药材后续研究提供更深入的理论依据和实践指导。

1 材料

1.1 试剂与药物 西藏凹乳芹引种自西藏，产于甘肃中医药大学和政药用植物园，经甘肃中医药大学药学院杜弢教授鉴定为伞形科凹乳芹属植物西藏凹乳芹Vicatiathibeticade Boiss.的根。芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号Y19N7S25244)。无水乙醇(分析纯，批号20190215)、氢氧化钠(分析纯，批号20161102)、硝酸铝(分析纯，批号20160411)(天津大茂试剂有限公司)；亚硝酸钠(分析纯，天津市化学试剂三厂)；水为超纯水。

1.2 仪器 电子天平(万分之一，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；超声波清洗仪(型号KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)；粉碎机(型号LG-500A，瑞安市百信药机械厂)；紫外可见分光光度计(型号UV-2401PC，上海元析仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品12.5 mg，置于25 mL量瓶中，70%乙醇超声提取并微热以使其溶解，放冷，定容，得到质量浓度为0.5 mg/mL的贮备液，精密吸取2、4、6、8 mL至10 mL量瓶中，70%乙醇定容，即得(质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)。

2.1.2 检测波长选择 参考文献[10-12]报道，精密吸取0.2 mg/mL对照品溶液2 mL，加入5% NaNO2溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，摇匀，静置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加入5 mL 10%NaOH溶液，70%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，在400～600 nm 波长处扫描，发现在510 nm处存在最大吸收，故选择其作为测定波长。

2.1.3 供试品溶液制备 将药材粉碎后过40目筛，封装于塑料袋中，置于阴凉干燥处，准确称取一定量粉末，用一定体积分数乙醇在一定超声功率下提取，抽滤，抽滤液置于100 mL量瓶中，一定体积分数乙醇定容至100 mL，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下5种质量浓度对照品溶液各2 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”项下方法测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，芦丁质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=11.938X+0.038 1(R2=0.997 5)，在0.008～0.04 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取0.2 mg/mL对照品溶液2 mL，按“2.1.2”项下方法测定吸光度6次，测得其RSD为0.64%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密称取药材粉末适量，在超声功率180 W、提取温度30 ℃条件下用5倍量70%乙醇提取2次，每次15 min，提取液抽滤后定容至1010 mL，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，每隔30 min测定1次，持续3 h，测得其RSD为1.44%，表明溶液在3 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一批药材粉末4.0 g，平行5份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，测得其RSD为2.13%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取药材粉末2.0 g，平行6份，分别精密加入1.02 mg/mL对照品溶液15 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率为97.70%，RSD为2.52%。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数 精密称取4.0 g药材，平行5份，固定液料比5∶1，提取时间15 min，提取次数2次，超声功率180 W，提取温度30 ℃，在乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%条件下进行提取，提取液过滤后定容，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，平行3次，结果见图1。由此可知，总黄酮含量随着乙醇体积分数增加呈先升后降的趋势，在70%、80%时无明显差异，但在90%时反而有所降低，其原因可能是大量醇溶性杂质浸出，从而影响黄酮在细胞中的渗透。

图1 乙醇体积分数对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content of total flavonoids

2.2.2 液料比 精密称取4.0 g药材，平行5份，固定提取时间15 min，提取次数2次，超声功率180 W，超声温度30 ℃，乙醇体积分数70%，在液料比2.5∶1、5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1条件下进行提取，提取液过滤后定容，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，平行3次，结果见图2。由此可知，总黄酮含量随着液料比增加呈先升后降的趋势，在5∶1时最高。

图2 液料比对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the content of total flavonoids

2.2.3 超声功率 精密称取4.0 g药材，平行6份，固定液料比5∶1，提取时间15 min，提取次数2次，乙醇体积分数70%，提取温度30 ℃，在超声功率90、120、150、180、210、240 W条件下进行提取，提取液过滤后定容，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，平行3次，结果见图3。由此可知，总黄酮含量随着超声功率增加逐渐升高，在150～210 W时更明显，在210 W时最高，但在210～240 W时反而逐渐降低，这可能是由于能量提高后被提取成分及其他杂质发生了复杂的物理和化学变化所致。

图3 超声功率对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of total flavonoids

2.3 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数(X1)、液料比(X2)、超声功率(X3)作为影响因素，总黄酮含量(Y)作为评价指标，含有5个中心点、17个试验点[13]，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

响应面分析见图4。由图4A可知，当乙醇体积分数恒定时，总黄酮含量随着液料比增加而升高，但趋势相对平坦；液料比不变时，总黄酮含量随着乙醇体积分数增加也呈升高趋势，但达到一定程度后反而降低，在75%～82%时更明显，并有最高值。由图4B可知，当液料比恒定时，总黄酮含量随着超声功率增加呈升高趋势；当功率不变时，总黄酮含量随着液料比增加而升高，但达到一定程度后反而有所降低。由图4C可知，当乙醇体积分数恒定时，总黄酮含量随着超声功率增加先升后降，并且趋势相对缓慢；超声功率不变时，总黄酮含量随着乙醇体积分数增加先升后降，曲面平坦，响应值变化较小。

图4 各因素响应面图Fig.4 Response surface plots for various factors

最终确定，最优工艺为乙醇体积分数81.96%，液料比4.89∶1，超声功率203.78 W。考虑到实际操作可行性，将其修正为乙醇体积分数82%，液料比5∶1，超声功率200 W，总黄酮含量为7.94 mg/g。

2.4 验证试验 取药材3份，按照优化工艺进行验证试验。结果，总黄酮含量分别为7.63、7.82、7.76 mg/g，平均7.74 mg/g，与预测值7.94 mg/g接近。

3 讨论

西藏凹乳芹可增长七精，加强体力，并具有开胃、助消化、抗疲劳、增强免疫、抗氧化、改善学习记忆等药理作用[14]，开发前景广阔。但对该药材药学方面的研究仍较薄弱, 导致其深度开发利用受到限制。

正交试验等线性模型的不足之处在于只能分析1个孤立的试验点，不能给出区域上因素最佳组合和响应最优值；Box-Behnken响应面法可通过多元二次回归方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，连续进行各水平分析，故其预测结果准确性较高[15-16]。本实验采用单因素试验结合Box-Behnken响应面法，选择乙醇体积分数、液料比、超声功率作为评价指标优化西藏凹乳芹总黄酮超声辅助提取工艺，验证试验表明该工艺稳定可行，对今后合理开发利用该药材具有指导意义。