四种精液处理方法在冷冻精子优选中的应用价值对比

李洪成

冷冻精子为男性计划生育的重要手段,通过停止精子代谢活动,以预防未来生育风险,可作为不孕不育辅助生育手段［1］。冷冻精子优选指通过一系列措施提升精子质量、提升成功孕育能力的重要措施。目前常见优选方式包括MACS、DGC、SU、SW 等,通过不同方式优化出最适宜精子样本,但目前关于何种优化方式更有利于保证精子正常形态、DNA 完整性研究较少。为此,本次研究选取辽宁省妇幼保健院2020年1～6月期间门诊41例志愿者的精液样本为研究对象,探究以上四种优选方式的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料 选取辽宁省妇幼保健院2020年1～6月期间门诊41例志愿者的精液样本为研究对象,志愿者的年龄26～37 岁,平均年龄(31.13±2.36)岁。精液样本纳入标准：精液液化时间正常,精液质量符合正常精液标准［2］。

1.2 实验仪器与试剂 ①miniMACS startingkit：购自德国美天旎生物技术有限公司；②Dead Cell Removal Kit：购自德国美天旎生物技术有限公司；③精子洗涤液：购自秒泉仪器有限公司；④PureCeption 24 测定双层试剂盒：购自秒泉仪器有限公司；⑤精子活体染色试剂盒：购自博瑞德生物科技有限公司,染色方法为伊红-苯胺黑染色法；⑥精子DNA 碎片测试试剂盒：购自博瑞德生物科技有限公司；⑦生物显微镜：购自日本,奥斯巴林CX41。

1.3 方法 将41例志愿者的精液样本等分为4 份,制备冷冻精液后,分别应用MACS、DGC、SU、SW 法处理,分别设为A 组、B 组、C 组、D 组。①MACS：1 ml 解冻精液+80 μl 1×结合缓冲液+20 μl MACS AnnexinV 磁珠,混匀,室温孵育15 min 后,加2 ml 精子洗涤剂,300 g 离心15 min,弃上清后加0.5 ml 1×结合缓冲液重悬,磁场分选柱干预后,以0.5 ml 1×结合缓冲液冲洗分选柱,重复3 次冲洗收集AnnexinV 阴性因子,300 g 离心15 min,弃上清,加0.5 ml 精子洗涤剂重悬,37℃保存；②DGC：以PureCeption 24 测定双层试剂盒制备密度梯度,形成下层1 ml 80% Isolate,上层1 ml 40% Isolate；取1 ml 解冻精液缓慢加入上层密度,300 g 离心20 min,保留下层,加入2 ml 精子洗涤液后300 g 离心5 min,弃上清,加0.5 ml 精子洗涤液重悬,37℃保存；③SU：1 ml 解冻精液+1.2 ml 培养液(在精液上方加入),离心管倾斜45°,37℃孵育1 h,保留上层培养液,300 g 离心5 min 后去上清,加0.5 ml 精子洗涤液重悬,37℃保存；④SW：1 ml 解冻精液+2 ml 精子洗涤液,混匀后300 g 离心5 min,弃上清,加0.5 ml精子洗涤液重悬,37℃保存。

1.4 观察指标及判定标准

1.4.1 比较四组优选前后的精子总数、向前运动精子活率 统计、计算四组精子总数,并统以向前运动精子数量,高倍镜下每份样本统计精子数量至少200 个,重复统计2 次。

1.4.2 比较四组优选前后的精子形态学状态 包括精子质膜完整率(伊红-苯胺黑染色法)、精子DNA 完整率(瑞士染液染色法,高倍镜下观察500 个精子,精子头部没有光晕或较小光晕即包含DNA 碎片)。判定标准见图1。

图1 DNA 碎片判定标准

1.5 统计学方法 采用SPSS24.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组优选前后的精子总数、向前运动精子活率比较 四组优选前的精子总数、向前运动精子活率比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。四组优选后的精子总数均低于本组优选前,且C 组的精子总数低于A、B、D 组,B 组的精子总数低于A、D 组,差异具有统计学意义 (P＜0.05)；A 组与D 组的精子总数比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。优化后,A、D 组的向前运动精子活率低于本组优选前,B、C 组的向前运动精子活率高于本组优选前,且B、C 组的向前运动精子活率高于A、D 组,D 组的向前运动精子活率高于A 组,差异具有统计学意义 (P＜0.05)；B 组与C 组的向前运动精子活率比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 四组优选前后的精子总数、向前运动精子活率比较()

表1 四组优选前后的精子总数、向前运动精子活率比较()

注：与本组优选前比较,aP＜0.05；与A 组优选后比较,bP＜0.05；与B 组优选后比较,cP＜0.05；与C 组优选后比较,dP＜0.05

2.2 四组优选前后的精子形态学状态比较 四组优选前的精子质膜完整率、精子DNA 完整率比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；四组优选后的精子质膜完整率、精子DNA 完整率均高于本组优选前,且A、B、C 组的精子质膜完整率、精子DNA 完整率均高于D 组,A 组的精子DNA 完整率高于B、C 组,差异具有统计学意义 (P＜0.05)。A、B、C 组的精子质膜完整率及B、C 组的精子DNA 完整率两两比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 四组优选前后的精子形态学状态比较(,%)

表2 四组优选前后的精子形态学状态比较(,%)

注：与本组优选前比较,aP＜0.05；与D 组优选后比较,bP＜0.05；与C 组优选后比较,cP＜0.05；与B 组优选后比较,dP＜0.05

3 讨论

精子样本解冻后优选结果,直接决定精子样本质量及男性孕育能力。精子样本冷冻时间延长、冷冻相关损伤均会在一定程度上造成精子损伤,出现质膜破碎、DNA 完整性丧失等,影响精液样本质量,因此需在精液样本解冻后进行样本优选,以保证样本质量［3,4］。

目前最常见的精液样本优选方式为SW,具有操作简单、处理时间短等优势,但本次研究发现,在优选前后,无论在精子总数、运动形态或在形态学比较中,尽管对精液样本起到一定的优化作用,但与其他三种优选方式相比,并未见明显优势。DGC 主要优选方式为,将精液中各种成分以不同密度溶液中自然分层平衡,从而分离出正常精子,此种优选方式操作相对简单,且从本次研究结果看,在向前运动形态及形态学完整率比较中,DGC 均表现出较好优势,提示了应用此种优选方式的临床价值,但反复离心可能会对精子造成一定程度的损伤［5,6］。SU 主要依据精子活力进行优选,与以上两种优选方式相比,此种优选方式主要优势为应用纯物理作用进行分离,对精子形态学完整性、向前运动活性影响较小,优选结果质量较高［7］。朱佳等［8］在对328例精子优选患者研究中发现,与Isolate 密度梯度法相比,DGC 精子活力显著提升,考虑原因与优化期间精子状态相关,与本次研究观点一致。但此种方式优化所需时间长,精子回收率较低,长时间操作可能会造成精子损伤,影响最终优选质量。MACS为利用磁力吸附法,将膜联蛋白V 与细小磁珠偶联,并将精子混悬液与磁珠混匀孵育,当精子出现死亡后,其内部磷酯酰丝氨酸会暴露在外部,与磁珠吸附,此时应用MACS 分选柱可利用磁力吸附凋亡精子,以完成优选结果［9,10］。本次研究结果发现,此种优选方式在精子总数及精子形态结构比较中,均表现出良好性能,特别在DNA 完整率比较中优势显著,考虑与此种优选方式对质膜碎裂、出现DNA 片段筛选能力较高相关；但本次研究发现,以MACS 优选后,向前运动精子活率水平相对较低,考虑原因可能与此种方式操作步骤较多、操作时间相对较长有关,进而影响精子状态。

综上所述,冷冻精子优选中,MACS、DGC、SU、SW 法各具优势,其中MACS 可提升精子形态学完整性,但影响精子活动状态,DGC、SU 可保证精子运动状态,且SU 可进一步提升精子活动能力,但两者所获精子总数相对较少,SW 操作简单,且对精子质量起到一定的优化作用,说明四种优化方式各具优势,因此在临床冷冻精子优化方式选择中,可结合实际需求、仪器设备等进行选择。