UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS整合网络药理学探讨树舌灵芝有效成分及其防治新型冠状病毒肺炎的可行性

刘 坤，殷九一，程 华，李会宣，李 娜，郭 彤，李 依，王俊丽，王军朋

(1.河北经贸大学生物科学与工程学院；2.河北经贸大学数学与统计学院，河北省 石家庄 050061；3.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081；4.中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081；5.河南大学淮河医院转化医学中心和感染免疫研究所，河南 开封 475000)

新型冠状病毒肺炎-2019(Corona Virus Disease-2019，COVID-19)是人体感染新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)而引起的一种急性呼吸道传染病[1]。截至2021年1月21日24时，全国累计报告确诊病例88 804例，79个国家确诊病例超过10万例，成为目前影响最大的流行性疾病[2]。大量研究已证实，血管紧张素转化酶Ⅱ(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、非结构蛋白-15核糖核酸内切酶(nonstructural protein-15 endoribonuclease，NSP15)、刺突蛋白受体结合域(the receptor-binding domain of spike protein，RBD of S protein)和主蛋白酶(main protease，Mpro/3CLpro)可以作为防止SARS-CoV-2感染的理想的药物作用靶点[3]。

树舌灵芝(Ganodermaapplanatum)有调节机体免疫系统，抗病毒抗炎和抗菌等药理活性[4]。其菌中的部分化合物具有抗病毒、抗纤维化和抗炎等生物活性，如：树舌灵芝的Applanatumin A具有抗纤维化作用[5]；其中的核酸可以减少鸡胚成纤维细胞组织培养中牛痘病毒斑块的数量[6]；其多糖具有抗SARS病毒的活性[7]。鉴于COVID-19的主要症状(咳嗽、呼吸困难、胸痛等)[8]、病因病机和树舌灵芝的传统功效，推测树舌灵芝在COVID-19的防治中发挥积极作用。

为了从现代科学角度充分分析树舌灵芝在COVID-19防治方面的物质基础及其作用机制，本课题组拟通过UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS系统鉴定其中的化学成分，运用网络药理学技术研究树舌灵芝化学成分在防治COVID-19过程中的功效及作用机制，通过分子对接技术进行有效成分与ACE2和3种SARS-CoV-2蛋白(NSP15，RBD of S protein，Mpro/3CLpro)的虚拟对接，预测树舌灵芝中化学成分抗SARS-CoV-2的活性，为树舌灵芝防治COVID-19的研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料树舌灵芝(Ganodermaapplanatum)采自东北阿尔山，经河北经贸大学张香美教授鉴定，标本(ZYMZDX121740)保存于中央民族大学生命科学与环境学院。树舌灵芝提取物为课题组提前制备。乙腈和甲酸(Thermo Fisher公司)均为色谱纯，超净水自制，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS系统：Thermo fisher U3000超高性能液相色谱仪，美国Thermo Scientific公司；Q Exactive PlusTMOrbitrap质谱系统，配有加热电喷雾电离源，美国Thermo Scientific公司。

2 方法

2.1 分析及鉴定

2.1.1液相条件 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS液质联用仪：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相为0.1%甲酸水溶液(B)-乙腈(A)。梯度洗脱：0～10 min，100% B；10～20 min，100%～70% B；20～25 min，70%～60% B；25～30 min，60%～50% B；30～40 min，50%～30% B；40～45 min，30%～0% B；45～60 min，0% B；60～60.1 min，0%～100% B；体积流量为0.2 mL·min-1；柱温30 ℃；DAD检测器，波长范围为200～400 nm；进样体积5 μL。

2.1.2质谱条件 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS液质联用仪：离子源为加热电喷雾电离源(HESI)，采用正负离子模式检测；质子扫描范围m/z100～1 500；喷雾电压为3.2 kV；离子传输管温度为320 ℃，辅气加热器温度为350 ℃；鞘气体积流量为40 arb，辅助气体积流量为15 arb；MS分辨率R为70 000，MS/MS分辨率R为17 500。

2.2 网络药理学分析

2.2.1药物成分潜在靶标预测 借助SwissADME(http://www.swissadme.ch/)数据平台对已鉴定的化学成分进行筛选，筛选条件为类药性(drug-likeness，DL)(5项中至少有3个“yes”)和胃肠道吸收(gastrointestinal absorption，GI)为“high”。再借助Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据平台，对符合筛选条件的化合物进行靶点预测。利用 UniProt 数据库(https://www.uniprot.org/)规范与活性成分相关的靶点蛋白，获得靶点对应的基因名。

2.2.2疾病靶点筛选 在Genecards(https://www.genecards.org)和Drugbank(https://go.drugbank.com/)数据库中输入关键词“novel coronavirus pneumonia”，搜索疾病靶点，同时运用Venny平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将树舌灵芝药效成分调控的靶点与疾病的治疗靶点取交集，得到树舌灵芝防治COVID-19的交集靶点。

2.2.3核心靶点及PPI网络分析 通过String数据库(hops://stringdb.org/)分析树舌灵芝防治COVID-19的交集靶点，构建靶点蛋白间的互做网络关系，将构建的PPI网络分析结果导入Cytoscape 3.8.0，根据度(degree，DC)、度介中心度(Betweenness Centrality，BC)和接近中心度(Closeness Centrality，CC)3个因素筛选网络中大于平均数的节点，进而确定核心靶点。

2.2.4靶点功能通路富集分析 借助于DAVID数据库(hops://david.ncifcrgov/)对疾病相关的药物活性成分靶点进行GO与KEGG富集分析，设定阈值P<0.05进行筛选，对相互作用的靶点进行功能富集分析，整理分析数据，选取前20个条目，利用R语言绘制柱状图与气泡图，用Cytoscape 3.8.0对网络进行可视化。

2.2.5“成分-靶点”的分子对接 从RSCB 数据库(http://www.rcsb.org/)中下载ACE2(PDB ID：IR42)、NSP15(PDB ID：6W01)、RBD of S protein(PDB ID：6M0J)及Mpro/3CLpro(PDB ID：6WNP)的蛋白质晶体结构[9]，使用Auto Dock Tools1.5.6软件删除晶体结构中的水分子，进行加氢处理，并且计算蛋白质的电荷，最后保存为pdbqt格式文件。从PubChem数据库获取小分子化合物的3D结构的SDF格式文件。利用PyRx软件(https://pyrx.sourceforge.io/)进行分子对接。

3 结果

3.1 树舌灵芝化学成分分析在上述色谱及质谱条件下，应用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS获取相应色谱质谱数据，利用Compound discover 3.1.0.305软件选取mzVault Best Match大于80的物质进行分析，根据色谱提供的准确相对分子量计算化合物的精确分子式，最终鉴定了化合物62个(Tab 1)，包括酚酸、香豆素、脂肪酸、萜和生物碱等多种成分。

Tab 1 Identification analysis of components of Ganoderma applanatum

Tab 2 Basic information of some chemical constituents in Ganoderma applanatum

3.2 网络药理学预测结果

3.2.1活性成分和疾病靶点筛选 通过Swiss ADME数据平台，对已鉴定的62个化学成分进行筛选，依据DL和GI的筛选条件，共筛选出30个主要活性化合物(Tab 2)。

采用Swiss Target Prediction数据平台对30个活性化合物进行靶点预测，去除重复靶点后，共得到树舌灵芝主要活性化合物潜在靶标593个。通过Genecards和Drugbank数据库，搜索到455个潜在作用靶点。将药物有效成分的靶点与疾病的靶点交叉，最终得到97个可能与树舌灵芝防治COVID-19相关的靶点。

3.2.2核心靶点及PPI网络分析 为了更好地分析树舌灵芝防治COVID-19的作用机制，运用String数据库构建了97个靶点的PPI网络，将数据导入Cytoscape 3.8.0，进行网络分析，包含97个节点和1 040条边。根据3个拓扑参数对PPI网络中所有节点进行分析，选取DC>23、BC>0.009和CC>0.541的32个靶点作为核心靶点，核心靶点相关信息见Tab 3。

Tab 3 Information on 32 core targets

3.2.3GO分析及KEGG通路富集分析 为了进一步分析候选靶点的可能作用，通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，得到GO条目217个(P<0.05)，包含生物过程(BP)条目158个、细胞组成(CC)条目19个和分子功能(MF)条目40个。排名前15的BP条目见Fig 1。KEGG通路富集分析筛选得到89条信号通路(P<0.05)，排名前20的通路及分类见Fig 2。

3.2.4树舌灵芝化合物-关键靶点-通路构建 使用 Cytoscape3.8.0软件对树舌灵芝30个核心成分及对应的32个核心靶点，核心靶点对应的20条主要通路进行分析，构建树舌灵芝防治COVID-19对应的核心化合物-核心靶点-通路图(Fig 3)。

Fig 1 GO biological process analysis of effective targets of compounds from Ganoderma applanatum

Fig 2 KEGG enrichment analysis of effective targets of Ganoderma applanatum

Fig 3 Core compound-core target-pathway diagram

3.2.5分子对接研究 将上述核心化合物及2种临床治疗药物分别与IR42和6W01、6M0J和6WNP靶标蛋白进行分子对接，从另一层面分析核心化合物防治COVID-19的可行性(Fig 4)。分子对接结合能越小，说明受体和配体之间的亲和力越大。

Fig 4 Heatmap based on binding energy among proteins and phytochemicals

4 讨论

本研究利用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS系统，快速鉴定到62个化合物，30个化合物GI和DL较好，其中含7个酚酸和4个香豆素。采用网络药理学方法构建药物活性成分-靶点-通路等网络，探讨树舌灵芝防治COVID-19的药用成分、潜在靶点和作用机制。在30个化学成分中，咖啡酸、七叶亭和瑞香素等在网络中具有重要作用。据报道，咖啡酸具有抗单纯疱疹病毒、甲型流感和犬瘟热病毒等活性。Mani等[10]对有望抑制人类冠状病毒的化合物进行了综述，其中包含咖啡酸。七叶亭可抑制HBV转染人肝癌细胞系(HepG2.2.15)中HBV抗原和HBV DNA的表达，亦可抑制体内HBV复制[11]。瑞香素具有一定的抗肠道病毒71的作用[12]。Maurya等[13]发现多个香豆素类物质与SARS CoV-2的甲基转移酶、核糖核酸内切酶和主要蛋白酶等受体蛋白可以很好的对接，可能会成为COVID-19感染有效的抑制剂。因此，树舌灵芝的这些酚酸和香豆素类成分可能会在防治COVID-19中发挥重要作用。

经网络药理学预测，IL-6、PTGS2和MAPK1等靶点具有重要地位。大量的数据显示细胞因子风暴是COVID-19患者一个重要的死亡原因。IL-6在细胞因子释放综合征中起重要作用，阻断IL-6信号转导通路有望成为治疗重症COVID-19患者的新方法[14]。MAPK1属于MAPK家族，MAPK信号通路可通过调节炎性反应、促进细胞凋亡和参与血管新生等多种途径在肺纤维化方面发挥着重要作用[15]。PTGS2(COX2)是主要的前列腺素合成酶，前列腺素E作用于下丘脑，可引发发热，亦具有血管扩张剂和抑制血小板聚集的作用；而凝血是COVID-19严重并发症，抑制PTGS2，可能会减少COVID-19相关的并发症[16]。因此，树舌灵芝的核心成分可能通过作用于IL-6、PTGS2和MAPK1等靶点对COVID-19起到防治作用。

通过KEGG富集分析发现前20条通路中，病毒传染性病占了7条，且PI3K-Akt、FoxO、TNF等多条信号通路与肺癌、肺部损伤以及气道炎症等肺部疾病密切相关[17]。其中PI3K-Akt通路最为显著，该通路参与病毒进入细胞的各个方面和免疫应答的发展。已有研究表明，SARS-CoV-2的内吞作用是通过网格蛋白介导的通路发生的，抑制PI3K/AKT途径可以抑制利用网格蛋白介导的内吞作用的病毒的进入，并且抑制PI3K/AKT信号通路可抑制NF-κB和AP-1，最终降低IL-6、TNF-α等炎症因子的表达。因此，可以推测树舌灵芝可能可以通过抑制PI3K/AKT信号通路，来抑制病毒进入细胞和抑制炎症，进而起到COVID-19的防治作用。

ACE2是SARS-CoV-2进入细胞的主要受体，一旦病毒与ACE2结合，它的内吞作用与血脑屏障病毒一起发生[18]。3种SARS-CoV-2蛋白，即NSP15、RBD of S protein和Mpro/3CLpro，是SARS-CoV-2感染宿主细胞或自我复制的关键蛋白。故将树舌灵芝中核心化学成分及西药与4个靶点进行分子对接比较，结果显瑞香素和1,4-二羟基-2-萘甲酸与NSP15和RBD of S protein的结合能分别为：-8.1 kJ·mol-1、-8.4 kJ·mol-1，均低于临床药物洛匹那韦和利巴韦林；小白菊内酯和1,4-二羟基-2-萘甲酸与Mpro/3CLpro和ACE2结合能分别为：-6.6 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1，略高于洛匹那韦，但低于利巴韦林。其他核心化合物如七叶亭和咖啡酸等的结合能与化学药相比，也有不同程度的降低。通过网络药理学和分子对接技术结果表明树舌灵芝对于治疗COVID-19应该有较好的疗效。

综上所述，基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS技术，本实验准确快速地对树舌灵芝中的化学成分进行了识别，较全面的揭示了树舌灵芝中的主要活性成分。同时基于网络分析与分子对接技术，以树舌灵芝为研究对象，对其主要化学成分、作用靶标及其关键药效成分与ACE2和3种SARS-CoV-2蛋白的结合能力进行分析，初步阐述了树舌灵芝防治COVID-19可能的物质基础与作用机制，为树舌灵芝抗COVID-19的进一步药效和临床疗效试验研究奠定基础。