汉防己甲素衍生物HL-49对Bloom DNA解旋酶生物学特性的影响

2022-02-24 06:47刘金河张望明晏文涛杨凯琳徐泽权刘杰麟
中国药理学通报 2022年2期
关键词:甲素防己偏振

刘金河,张望明,晏文涛,向 天,罗 维,杨凯琳,徐泽权,刘杰麟

(1.贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室,组织工程与干细胞实验中心,贵州省再生医学重点实验室,贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学基础医学院免疫教研室,贵州 贵阳 550025;3.贵州中医药大学第一附属医院检验科,贵州 贵阳 550001;4.贵州医科大学检验学院,贵州 贵阳 550004)

Bloom DNA解旋酶(bloom DNA helicase,BLM)是RecQ解旋酶家族中的一员,能利用三磷酸腺苷(ATP)和其他三磷酸核苷水解释放的能量解开双链DNA或G四链体,是核酸复制、重组、修复、转录、端粒稳定等代谢过程的重要组成部分[1-2]。

研究发现,BLM基因突变能引起皮肤鳞状细胞癌的发生[3]和前列腺癌转移有关[4]。Wang等[5]发现喹唑啉酮为母核合成的衍生物中,9 h能显著抑制BLM 解旋酶与DNA的结合活力,也促进端粒DNA的瓦解,诱导细胞凋亡。因此,研究小分子对BLM DNA解旋酶功能的影响及以BLM DNA解旋酶为靶向的肿瘤治疗具有重要意义。

汉防己甲素(tetrandrine,TET)是一种双苄基异喹啉类生物碱,具有广泛的抗肿瘤活性,例如肺癌、结肠癌、乳腺癌等[6]。临床研究发现,该药物毒性小、副作用低,后期成药性较好。TET能通过上调IGFBP-5蛋白的表达增强p53蛋白表达进而抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖[7],Li等[8]研究发现,TET通过调节CCND1/CDK4化合物及其下游蛋白磷酸化Rb(p-Rb)抑制结肠癌 HT-29 细胞的生长。Bhagya等[9]证实了TET激活活性氧(reactive oxygen species,ROS)进而通过caspase 途径诱导乳腺癌和胰腺癌细胞凋亡,Sun等[10]发现TET柠檬酸盐上调 ROS 水平,下调Bcl-2以及上调cleaved caspase-3、Fas、p-p38和 p-JNK 的表达水平来介导抗肿瘤活性。因此TET抗癌潜在分子机制可能与诱导癌细胞凋亡、抑制细胞增殖、迁移、侵袭并抑制肿瘤细胞生长有关[6]。

目前研究汉防己甲素衍生物对肿瘤抑制作用的文章不多,以BLM DNA解旋酶作为靶点,分析其与BLM DNA解旋酶相互作用的分子机制的文章鲜见报道。本文拟使用荧光偏振检测、紫外光谱扫描、孔雀绿-磷钼酸铵比色等技术和方法,通过研究汉防己甲素衍生物HL-49对BLM DNA解旋酶结构和生物学活性的影响,揭示汉防己甲素衍生物抑制肿瘤细胞生长的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂汉防己甲素衍生物HL-49:(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室潘卫东教授课题组)提供;ssDNA底物委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。序列如下:A1(45bp):5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGTTAGGTTAGGTT-AGTTTTTTTTTT-3′;A2(21bp):3′-FAM-TTAGGCA-GCTCGTCTCAATCC-5′。(注:FAM为羧基荧光素)。

DNA底物杂交缓冲液(20 mmol·L-1Tris-HCl,100 mmol·L-1NaCl,pH 7.9);荧光偏振实验反应缓冲液(20 mmol·L-1Tris-HCl,25 mmol·L-1NaCl,3 mmol·L-1MgCl2和0.1 mmol·L-1DTT,pH 7.9);紫外光谱实验缓冲液buffer C (20 mmol·L-1Tris,500 mmol·L-1NaCl,500 mmol·L-1咪唑,10%甘油,pH 7.9);ATPase活性检测实验所需三乙醇胺、孔雀绿、钼酸铵均用双蒸水进行配置。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器NGCTM蛋白质分离纯化系统(美国BIO-RAD公司);高压细胞破碎仪(英国Constant Systems公司);Synergy 4多功能酶标仪(美国BIO-TEK公司);UV-2100紫外可见分光光度计(日本SHIMADZU公司);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore Corp公司)。

1.3 方法

1.3.1BLM DNA解旋酶的制备、纯化 将表达 BLM DNA 解旋酶的重组大肠杆菌置于含有 50 mg·L-1氨苄青霉素+30 mg·L-1氯霉素的LB培养基中,在37 ℃、160 r·min-1的条件下扩大培养至OD值达到0.5。然后转到18 ℃、180 r·min-1的条件,加入终浓度0.4 mmol·L-1IPTG 诱导Bloom DNA解旋酶表达20 h,随后在4 ℃、4 000 r·min-1的条件下离心15 min收集菌体。使用高压细胞破碎仪在21 kpsi压力下进行一次性破碎,收集流出液,4 ℃、13 000 r·min-1的条件下离心45 min收集上清液,通过镍亲和层析和分子筛层析进行分离纯化,获得能用于进行酶生物学特性研究的重组BLM DNA解旋酶[11]。

1.3.2HL-49对 BLM DNA解旋酶紫外光谱的影响 Buffer C 缓冲液(pH 7.9)中加入终浓度为2.7 μmol·L-1的BLM DNA解旋酶与不同终浓度(0~20 μmol·L-1)的HL-49,保持整个反应体系总体积为200 μL。将混合液置于紫外分光光度计测量室内,设定扫描速度为中等速度,扫描波长间隔为1 nm,在230~300 nm波段下进行扫描,以每5 min扫描1次的频率扫描至平衡,取3次平衡值的图谱进行拟合。根据光谱峰值和峰形的变化即可判定蛋白质的构象是否发生变化[11]。再用相同的方法扫描其余不同终浓度(0~20 μmol·L-1)的 HL-49 在buferC缓冲液中的紫外吸收光谱。

1.3.3HL-49对BLM DNA解旋酶的DNA结合活性的影响 本实验采用荧光偏振法测定 HL-49对 DNA与BLM DNA解旋酶结合活性的影响。采用2种方式研究 HL-49对BLM DNA解旋酶 DNA结合活性的影响[12]。第1种,25 ℃下,用不同浓度的HL-49(0~25.33 μmol·L-1)滴定BLM DNA解旋酶与2 nmol·L-1的DNA(A2或A1A2)相互孵育形成的复合物;第2种是25 ℃下,不同浓度的HL-49先与BLM DNA解旋酶反应5 min,再加入到含2 nmol·L-1DNA(ssDNA/dsDNA)的反应缓冲液中进行检测。实验重复3次,数据为3~5个稳定偏振值平均之后的结果。通过调节双蒸水的体积,使实验的总体积保持在150 μL。

1.3.4HL-49 对 BLM DNA 解旋酶 DNA 解链活性的影响 本实验采用荧光偏振法检测HL-49对BLM DNA解旋酶DNA解链活性的影响。取终浓度为75 nmol·L-1的BLM DNA解旋酶与不同终浓度(0~20 μmol·L-1)的HL-49混匀,在室温下孵育5 min,加入到含2 nmol·L-1的dsDNA的反应缓冲液中,测定荧光偏振值至稳定,再加入终浓度为0.2 mmol·L-1的ATP,测定荧光偏振值至稳定。取各个反应稳定时5~7个的荧光偏振值的平均值,实验重复3次。通过调节双蒸水的体积,使本次实验的总体积保持在150 μL。DNA解链的速率常数可根据方程(1)获得:

At=A1exp(-kobst)

(1)

式中At是解链时间为t时的荧光偏振值,A1是解旋酶与dsDNA完全结合时的荧光偏振值。

1.3.5HL-49 对 BLM DNA 解旋酶 ATP 酶活性的影响 本实验采取孔雀绿-磷钼酸铵比色法来测定 HL-49 对 BLM DNA解旋酶 ATPase 活性的影响。首先,反应缓冲液(50 mmol·L-1三乙醇胺、50 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1MgCl2,pH 7.5)中加入终浓度为100 nmol·L-1的ssDNA,终浓度为75 nmol·L-1的 BLM DNA 解旋酶和不同终浓度(0~100 μmol·L-1)的HL-49于室温下孵育10 min。随后加入终浓度为2 mmol·L-1的ATP,在室温下分别孵育(0、5、10、15、20、25、30)min,通过调节双蒸水的体积,使本次反应的总体积保持在75 μL。然后取 50 μL上述反应液迅速加入850 μL染液(36 mL 0.045%孔雀绿溶液,12 mL 4.2%钼酸铵溶液,1 mL 1%的Triton X-100)中以终 ATP的水解反应,在3 min时,往染液中加入100 μL 34% 的柠檬酸溶液来终止显色反应。终止显色反应后,各不同浓度药物组吸取100 μL 加至96孔板中,于660 nm波长处读值,实验重复3次。使用国际单位定义表示酶量的多少,即每分钟催化1 μmol底物水解所需的酶量为1个国际单位(unit)。酶活力Activity(kU·L-1·min-1)可通过以下公式(2)计算

(2)

式中,A是根据标准曲线得出的磷酸盐浓度(μmol·L-1),B是反应时间(min)。

2 结果

2.1 HL-49对BLM DNA解旋酶的构象无影响HL-49对BLM DNA解旋酶紫外光谱影响的实验结果见Fig 2。对于蛋白质来说,肽键的强吸收峰一般出现在210~240 nm处,而芳香族氨基酸残基中共轭双键的吸收峰出现在280 nm附近。由 Fig 2A可以看出,HL-49在238 nm和280 nm 处具有两个峰。随着HL-49浓度的增加,BLM DNA 解旋酶在236 nm和280 nm处的峰位置和峰型未发生明显变化(Fig 2B),再结合HL-49对BLM DNA解旋酶在236 nm和280 nm处的紫外吸收值约等于HL-49和BLM之和(Fig 2C)可知两者之间并无相互作用,由此推断HL-49不能改变BLM DNA解旋酶的三维构象。

Fig 1 Determination of BLM DNA helicase purity after molecular sieve chromatography

2.2 HL-49对BLM DNA解旋酶的DNA结合活性无影响HL-49对BLM解旋酶的DNA结合活性的影响见Fig 3。由图Fig 3A和Fig 3B可知,无论是dsDNA(Fig 3A)还是ssDNA(Fig 3B)作为底物,HL-49对BLM DNA解旋酶因结合而增加的荧光偏振值影响非常小,也不具浓度依赖性,荧光偏振值的增量(ΔA1,ΔA2)无明显变化(P>0.05),说明HL-49并不影响BLM DNA解旋酶与DNA的结合;然而,HL-49 单独滴定dsDNA或者ssDNA 时,荧光偏振值的增量(ΔA3)随着HL-49浓度的增加而明显增大(P<0.01),说明HL-49可与DNA(dsDNA or ssDNA)相结合(Fig 3C),且结合能力与HL-49的浓度呈正相关。

Fig 2 The Ultraviolet (UV)absorption spectra of HL-49 interacted with BLM DNA helicaseA:The changes of UV absorption spectra by different concentrations of HL-49;B:The changes of UV absorption spectra by different concentrations of HL-49 interacted with BLM helicase treatment;C:The UV absorption spectra of BLM (2.7 μmol·L-1),BLM (2.7 μmol·L-1)and HL-49(10 μmol·L-1),HL-49(10 μmol·L-1 );D:The titration curve of BLM helicase for the addition of HL-49 at the 236 nm.

2.3 HL-49能抑制 BLM DNA 解旋酶的DNA解链活性利用荧光偏振方法研究HL-49对BLM DNA解旋酶的DNA解链活性的影响。由Fig 4A可知,随着反应体系中HL-49终浓度的逐渐增加(0~25.33 μmol·L-1),因解链而降低的荧光偏振值(A1-A2)逐渐减小,表明BLM DNA 解旋酶的解链活性与HL-49的浓度呈负相关。根据公式(1)进一步分析HL-49存在下BLM解旋酶的Kobs值的变化(Fig 4B),可知随着HL-49浓度的增加,BLM解旋酶的Kobs值逐渐减小,表明HL-49能够明显抑制BLM解旋酶的DNA解链活性。

Fig 3 Effects of HL-49 on DNA-binding activity of BLM DNA Fluorescence anisotropy values were determined as a function of the helicase concentration both A and B.C:The effects of HL-49 on dsDNA and ssDNA were assayed by fluorescence polarized technology.2 nmol·L-1 DNA substrate was pre-incubated in the DNA binding buffer for 5 min at 25 ℃.ΔA1 and ΔA2 represent the increased value of the total fluorescence polarization value after the addition of HL-49 minus the fluorescence polarization value of DNA.ΔA3 represents the total fluorescence polarization value of HL-49 after addition minus the value of DNA.

Fig 4 Effects of HL-49 on DNA unwinding activity of BLM DNA A:Effects of different concentrations of HL-49 on the unwinding activity of BLM.B:The change of Kobs values of the BLM helicase to dsDNA in the presence of different concentrations of HL-49.The Kobs values were calculated from equation (1).A1 is the fluorescence polarization value of HL-49 interacting with BLM helicase and DNA at different concentrations.A2 is the fluorescence anisotropy of the reaction system after the addition of 2 nmol·L-1 ATP.

2.4 HL-49 能抑制BLM DNA 解旋酶的ATPase活性由Fig 5A所示可知,随着HL-49浓度的逐渐增加,BLM DNA解旋酶的ATPase活性逐渐降低,揭示出BLM DNA解旋酶的酶活力与HL-49的浓度呈负相关(P<0.01)。由Fig 5B可知,在相同HL-49浓度下,随着时间的延长(0~30 min),BLM DNA解旋酶的酶活力逐渐下降。通过米氏方程双倒数作图法进一步分析实验数据,计算出酶反应的Vmax、Km等常数,结果见Tab 1,可知随着HL-49浓度的增加,Vmax保持不变,而Km逐渐增大,且Kcat减小,说明HL-49对BLM DNA解旋酶的作用为可逆性竞争性抑制作用。

Fig 5 Effects of HL-49 on ATPase activity A:Curves of activity that based on the equation (2)of recombinant BLM helicase in the presence of different concentrations of HL-49.In each reaction,DNA was present at a concentration of 100 nmol·L-1 and ATP was 2 mmol·L-1.B:Time course of ATP hydrolysis by 2.7 μmol·L-1 recombinant BLM helicase in the presence of different concentrations of HL-49 at 30 min.Experiments were performed at 25 ℃ in ATPase activity assay buffer containing 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7.9),2.5 mmol /L MgCl2.

Tab 1 The ATPase activity constants of HL-49 interacted with BLM DNA helicase

3 讨论

由紫外光谱扫描和DNA结合实验结果可知,HL-49不会改变BLM DNA解旋酶的构象,也不会与其相互结合,且能与DNA(dsDNA/ssDNA)相互结合并具浓度依赖性。DNA解链活性的结果显示:随着HL-49浓度增大,BLM DNA解旋酶的解链活性逐渐受到抑制,抑制作用明显(P<0.01)。ATPase活性随着时间的延长而明显降低,且随着HL-49浓度的增加,ATPase活性逐渐降低。由此可知,BLM DNA解旋酶的ATPase活性具时间依赖性和浓度依赖性,进一步分析酶的相关动力学参数Km逐渐增大、Vmax不变且Kcat值减小,可知HL-49抑制BLM DNA解旋酶生物学活性的类型为DNA的可逆性竞争。由以上实验结果可知,HL-49抑制BLM DNA解旋酶的生物学活性的可能机制为HL-49可逆性结合于DNA(ssDNA/dsDNA)链上,阻碍BLM DNA解旋酶与DNA的结合,进而影响BLM DNA解旋酶的DNA解链活性和ATPase活性。

BLM DNA解旋酶作为人体细胞当中存在的一种具解开双链DNA活性的蛋白,在DNA的复制、重组、转录和端粒维持的功能中发挥重要作用。BLM基因的表达异常造成BS综合征,其临床表现为高水平的姐妹染色单体互换、身材矮小、免疫系统缺陷、不孕不育、癌症发生率高[12]。

BLM DNA解旋酶在大多数肿瘤细胞中普遍高表达,但表达水平因肿瘤细胞系而异[13],故以BLM DNA解旋酶为抗癌研究靶标,利用小分子化合物抑制癌症细胞中BLM DNA解旋酶的表达及活性,抑制细胞的增殖,最终抑制癌症的发生发展,在理论上是可行的。因此,寻找一种疗效好,副作用低,成本低廉且靶向抑制BLM DNA解旋酶活性的小分子化合物具有显著的临床意义。而汉防己甲素目前作为临床常用药物,普遍用来治疗各种炎症反应,毒副作用很小,且提炼成本较低,具有先天优势,在此基础上改造而来的一系列汉防己甲素衍生物,比如HJNO,HL-49[14-15],都表现出了很好的抗肿瘤活性,而本文对HL-49抑制肿瘤的分子机制的研究印证了其抗肿瘤活性。该研究的结果能为后续的动物实验、临床实验提供一定的参考。

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