百会、神庭电针干预对脑卒中大鼠认知功能的改善及对血管新生相关因子eNOS、NO表达的影响

李鹏飞，任俊华，苏 滑，杨来福

(1.开封市中心医院，河南 开封 475000;2.郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450000;3.新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453100)

脑卒中是一种骤然起病的脑循环障碍性疾病，已成为全世界第二大致死性疾病，且近年来在我国发病率逐渐上升[1]。资料显示[2]，超过60 %的脑卒中患者存在认知障碍，严重影响功能恢复及日常生活。研究表明[3-4]，脑卒中病理损伤后病灶周围血管新生是形成新脑血管脑络的基础，且是决定缺血性神经元存活的关键因素，有利于挽救缺血半暗带，与认知障碍程度密切相关。目前溶栓是临床治疗脑卒中的主要方式，但仅适用于时间窗内患者，且副作用较大，因此探寻更为安全、有效的治疗方式成为研究热点。中医传统针刺治疗承载着深厚的理论及实践经验，已逐渐应用于脑卒中治疗，且效果良好，但关于其发挥作用的具体机制尚在探索阶段[5-6]。本研究通过建立脑卒中大鼠模型，观察百会、神庭电针干预对其认知功能及血管新生的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 65只清洁级SD雄性大鼠，6周龄，体质量190～210 g，购自北京华益健康药物研究中心，生产许可证号：SYXK(京)2019-0035。自由进食、饮水，温度24～26 ℃，自然光照，适应性饲养1周。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器 内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/一氧化氮(Nitricoxide，NO)通路抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)(上海恒远生化试剂有限公司)；CD31免疫组化试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；兔抗鼠eNOS、p-eNOS和NO一抗，山羊抗兔IgG二抗(美国Santa cruz公司)；6805-D电针仪(汕头市医用设备厂有限公司)；水迷宫装置(北京硕林苑科技有限公司)；激光多普勒血流仪(上海玉研科学仪器有限公司)；RM2235病理切片机[徕卡显微系统(上海)贸易有限公司]；Synergy-HD显微镜(日本Toshiba公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组 采用改良Longa线栓法[7]。55只大鼠50 mg/kg ，2 %戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪开左侧颈部，钝性分离肌群，游离颈总、内和外动脉，结扎颈总动脉近心端、颈外动脉，夹闭颈内动脉远端，颈总动脉附近1 cm切口，插入尼龙线至颈内动脉，深度20 mm，扎紧动脉残端，常规缝合。大鼠清醒后单笼饲养，以Longa神经功能评价方法评价其神经功能:1分(提尾时左侧前肢屈曲且不能伸展);2分(爬行时出现追尾表现或向左侧划圈);3分(爬行困难，向左侧倾倒)提示建模成功;剔除0分(无明显神经功能缺失表现)和4分(意识丧失，不能爬行)。剩余10只大鼠将阻塞线插入颈内动脉深度约5 mm，剩余步骤同上，设为假手术组。40只大鼠造模成功，随机分为脑卒中组、电针组、L-NAME组和电针+L-NAME组，各10只。

1.2.2 干预方式 胶带粘牢大鼠前后肢。

1.2.2.1 电针组 采用百会、神庭电针干预，建模后24 h参照《实验针灸学》[8]确定百会及神庭穴位置，选用30号15 mm毫针，以30 °斜向刺入皮肤，深度2 mm左右，随后采用电针仪，电压峰值6 V，疏密波，频率1/20 Hz，当针体轻抖时即为得气。20 min/次，1次/d，连续14 d。建模后1 h、12 h和36 h行生理盐水腹腔注射，每次5 mg/kg

1.2.2.2 L-NAME组 在建模后1 h、12 h和36 h行L-NAME腹腔注射，每次5 mg/kg。

1.2.2.3 电针+L-NAME组 采用百会、神庭电针联合L-NAME干预，操作同电针组与L-NAME组。

1.2.2.4 假手术组与脑卒中组 实施非穴刺激，取双侧肋下非穴、非经位置：低于肋部且高于髂嵴15 mm，其余针刺操作同电针组。在建模后1 h、12 h和36 h行生理盐水腹腔注射，每次5 mg/kg。

1.2.3 Morris水迷宫实验 末次干预后4 h开展Morris水迷宫实验。采用大鼠通用型圆形水迷宫装置，水池120 cm×60 cm，水深25 cm，水温23 ℃。将水池分为4个象限，第3象限中心放置高23 cm、直径10 cm的圆形平台。任选1象限面向池壁放入大鼠，记录其60 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)，超过60 s未找到平台，记录潜伏期为60 s，训练2次/d，每次间隔20 min，共持续5 d。第6天撤走平台，将大鼠从原先象限对侧入水，记录逃避潜伏期、目标象限停留时间和穿越原平台次数。

1.2.4 检测缺血局部脑血流量 戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，以俯卧位将其固定于脑立体定位仪上，前囟右旁开口约3 mm，后移3 mm钻孔，直径1 mm，暴露脑组织。采用医用耳脑型胶将激光多普勒血流仪光纤探头固定于脑立体定位仪上，与病灶侧脑皮质接触，检测中动脉供血区血流量，获取脑血流速度。

1.2.5 组织取材 Morris水迷宫实验及缺血局部脑血流检测完成后，颈椎脱臼处死大鼠，剪开右心耳，心尖灌注100 mL预冷PBS，至肺、肝变白，右心房流出澄清液体，断头，取出完整脑组织，预冷生理盐水冲洗表面血液，其中5只冲掉表面血迹后滤纸吸干，用于检测脑组织含水量，其余5只按照《大鼠脑立体定位图谱》中定位方式切取患侧海马组织及脑皮质组织[9]，滤纸吸干，海马组织固定于4 %多聚甲醛中用于HE染色，脑皮质组织分为2份，1份固定于4 %多聚甲醛中用于免疫组织化学染色，1份保存于液氮中用于Western blot检测。

1.2.6 检测脑组织含水量 取完整脑组织，天平称重量，并记为湿重；随后电热恒温干燥箱烘干脑组织至重量不再发生变化，天平称重并记为干重。计算含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100 %。

1.2.7 HE染色观察患侧海马区病理变化 取4 %多聚甲醛固定的脑组织，酒精梯度脱水、包埋，病理切片机制作成连续切片，厚度4 μm，二甲苯脱蜡、酒精水化，常规HE染色，中性树胶封片，显微镜观察患侧海马区病理变化。

1.2.8 免疫组织化学染色观察缺血周边区域新生血管密度 取4%多聚甲醛固定48 h的患侧脑皮质组织，石蜡包埋，视交叉前缘切片(厚度8 μm)，采用CD31免疫组化试剂盒行染色标记，DAB显色试剂盒显色15 min，苏木精复染，经二甲苯透明后封片。显微镜下观察，随机选取缺血周边区域5个不相邻视野，计算机图像分析系统计数阳性细胞(细胞被染成棕黄色或黄色)，反映新生血管密度。

1.2.9 Western blot检测脑组织eNOS、p-eNOS及NO蛋白相对表达量 取液氮保存的患侧脑皮质组织40 mg，充分研磨后转移至离心管，RIPA裂解液冰上裂解，30 min后10 000 r/min，离心半径8 cm离心15 min，BCA试剂盒定量蛋白后，将40 μg待检测样本混合2倍体积上样缓冲液，沸水浴使蛋白变性，10 000 r/min，离心半径8 cm离心15 min，取上清，恒压下行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转至硝酸纤维素膜，封闭液封闭2 h，与兔抗大鼠11 000 eNOS、p-eNOS及NO一抗(1∶1 000)混合，4 ℃摇床孵育过夜，TBST充分洗涤，与山羊抗兔IgG二抗(1:5 000)混合后室温孵育1 h，加入ECL化学显色剂，暗室显影，凝胶成像系统扫描并分析灰度值，以eNOS、p-eNOS及NO/GADPH灰度值表示其蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组认知功能比较

L-NAME组、脑卒中组、电针+L-NAME组、电针组和假手术组逃避潜伏期依次缩短，目标象限停留时间依次延长，穿越原平台次数依次增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组认知功能比较

2.2 各组患侧中动脉供血区脑血流速度、脑组织含水量比较

L-NAME组、脑卒中组、电针+L-NAME组、电针组和假手术组脑血流速度依次加快，脑组织含水量依次减少(P<0.05)。见表2。

表2 各组患侧中动脉供血区脑血流速度、脑组织含水量比较

2.3 HE染色观察各组海马区病理变化

假手术组神经元排列整齐，形态正常、核膜完整、核仁清晰和染色质均匀分布；脑卒中组神经元数量减少、排列紊乱和间隙变大，细胞核固缩、胞浆深染，可观察到变性坏死神经元；L-NAME组病理改变较脑卒中组更为严重；电针组、电针+L-NAME组干预后神经元数量增加，核膜及核仁较清晰，损伤程度减轻，电针组较电针+L-NAME组改善效果更为明显。见图1。

2.4 各组新生血管密度比较

假手术组、L-NAME组、脑卒中组、电针+L-NAME组和电针组新生血管密度依次增加(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组新生血管密度比较

2.5 各组脑皮质NO蛋白相对表达量、p-eNOS/eNOS比较

假手术组、L-NAME组、脑卒中组、电针+L-NAME组和电针组NO蛋白相对表达量、p-eNOS/eNOS依次升高(P<0.05)。见表4、图3。

表4 各组脑皮质NO蛋白相对表达量、p-eNOS/eNOS比较

3 讨论

脑卒中是一种脑血管阻塞或破裂导致血循障碍引起脑组织损伤的急性脑血管疾病。血管新生是指毛细血管自血管侧支出芽、再塑，包括血管扩张、增加内皮通透性、溶解基底膜及内皮细胞增生、迁移和形成管腔等多个连续环节，是脑卒中后神经功能恢复的关键[10]。研究认为[11]，尽管脑卒中后梗死区域可观察到血管新生，但该代偿机制难以满足脑缺血所致脑损伤恢复的需要。因此，探究脑卒中后血管再生诱导方式，促进缺血半暗带侧支循环建立，并寻找对应靶点对于改善脑卒中预后至关重要。

脑卒中后认知功能障碍属于中医“呆病”“痴症”等范畴，以思维、判断、记忆和执行能力受损为主要表现，病位于脑，病机为脑脉痹阻、脑髓失养[12]。文献指出[13]，督脉在经络联系上属脑，在病理表现上和脑部认知功能密切相关，具有神、形共调的功效。百会穴属督脉，与任脉交互，统督诸阳，可升可降，能补能泻，补神益智、疏通脑络和协调百脉。神为天部之气，庭为聚散之所，神庭穴亦属督脉，且是督脉、太阳和足阳明3条经脉之会，有报道指出该穴可平喘降逆、宁神醒脑，是诸多医家治疗神经系统疾病时的要穴之一[14]。本研究结果中，与脑卒中组比较，电针组逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间延长，穿越原平台次数增加，脑血流速度加快，脑组织含水量减少，海马区病理变化减轻，且新生血管密度增加，提示电针百会、神庭穴可改善大鼠认知功能、脑血流速度、脑水肿和病理变化，促进血管新生。Liu等[15]研究显示，百会、神庭电针干预脑卒中大鼠可预防缺血再灌注损伤，并减少缺血周围区域神经元凋亡。Wen等[16]认为，百会、神庭电针持续14 d干预缺血性脑卒中大鼠后，其脑梗死体积缩小，且可通过激活海马、扣带回、前缘皮层和感觉皮层等认知相关区域改善学习记忆能力，提示该治疗方式在治疗脑卒中时具有积极作用。

NO是血管内皮细胞分泌的血管生成必需调节因子，对内皮细胞迁移、增殖具有诱导作用，且可通过调节多种血管生成因子从而影响血管新生，促进毛细血管管腔形成，其异常表达与血管再狭窄、动脉粥样硬化、高血压和脑卒中等心脑血管疾病发生、发展密切相关。eNOS是NO生成过程中的关键性调节酶，两者激活是脑缺血后适应的延迟保护效应，是自我保护机制之一。Zhang等[17]发现，通过改善eNOS的解偶联和激活eNOS/NO可改善缺血再灌注诱导的脑内皮通透性增强，从而修复血脑屏障，提示该通路在脑卒中进程中的作用。此外，有动物实验结果表明[18]，Akt/eNOS被激活后，中脑动脉阻塞大鼠模型神经功能、认知功能均有所改善，神经元凋亡减少，且血管生成增加，暗示该通路可能是治疗脑卒中的潜在靶点之一。本研究结果显示，采用eNOS/NO抑制剂L-NAME干预后，大鼠认知功能、脑组织含水量、脑血流速度、新生血管密度及病理变化等改善效果均降低，且假手术组、L-NAME组、脑卒中组、电针+L-NAME组和电针组NO蛋白相对表达量、p-eNOS/eNOS依次升高，提示百会、神庭电针干预对脑卒中的治疗效果可能通过调控p-eNOS、NO蛋白表达实现。

综上所述，百会、神庭电针干预可改善脑卒中大鼠认知功能、脑水肿，加快脑血流速度，促进血管新生，改善病理变化，推测其作用机制与促进血管新生相关因子p-eNOS、NO表达有关。