16 种医用口罩口罩带的细胞毒性

曾亚力，王蕊，管博，李华，戴政宁，贺学英（通信作者）

北京市医疗器械检验所（北京 101111）

暴发于2019年底并持续蔓延的新型冠状病毒肺炎疫情对全世界人民的健康和生活均造成了严重影响，经呼吸道飞沫和接触传播是新型冠状病毒的主要传播途径[1]。医用口罩对于气溶胶、飞沫等具有良好的过滤防护效果，且能够预防呼吸系统疾病，其不仅是抗疫一线工作者必备的防护用品，还是人民群众预防新型冠状病毒肺炎的生活必需品[2-3]。

目前，我国有3个医用口罩相关标准。其中，国家标准GB 19083-2010《医用防护口罩技术要求》[4]是强制性标准，符合该标准的口罩称为医用防护口罩；行业标准YY 0469-2011《医用外科口罩》[5]也是强制性标准，符合该标准的口罩称为医用外科口罩；行业标准YY/T 0969-2013《一次性使用医用口罩》[6]是推荐性标准，符合该标准的口罩称为医用普通口罩。YY/T 0969-2013和YY 0469-2011对口罩的细胞毒性有技术要求，但未明确说明口罩主材和口罩带是分别取材还是两者按一定比例混合取材进行试验，检验人员一般会选取口罩主材进行细胞毒性试验，对口罩带未做系统性研究，因此，相关标准宜对口罩的细胞毒性要求进行细化[7-8]。本研究选取了国内14个厂家的16种医用口罩（市售5种，注册中11种），在现行安全使用的前提下依据GB/T 16886.5-2017 《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》[9]对口罩带的细胞毒性进行了研究，以期为相关标准修订时对口罩带细胞毒性做出合理要求提供数据支持。

1 材料

1.1 主要试剂

L-929细胞，由美国菌种保藏中心提供；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），由Sigma-Aldrich公司提供，规格1 g/瓶；MEM培养基，由CORNING MEM培养基公司提供，规格500 ml/瓶；小牛血清，由天津康源生物技术有限公司提供，规格200 ml/瓶；异丙醇，由西陇化工股份有限公司提供，规格500 ml/瓶；二甲基亚砜，由国药集团化学试剂有限公司提供，规格500 ml/瓶。

1.2 仪器

台式恒温振荡器，型号THZ-D，由苏州培英实验设备有限公司提供；酶标仪，型号Multiskan Mk3，由赛默飞世尔（上海）仪器有限公司提供；电子天平，型号BSA3202S-CW，由赛多利斯科学仪器（北京）有限公司提供。

1.3 试验样品

1.3.1 被检样品

将来自14个国内厂家的16种医用口罩依次编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、11#、12#、13#、14#、15#、16#，基本信息见表1。

表1 16种医用口罩的基本信息

1.3.2 对照样品

阳性对照样品选择5%（V/V）的二甲基亚砜，阴性对照样品选择高密度聚乙烯[9-10]。

2 方法

2.1 MTT 溶液的配制

将5 mg MTT 溶于1 ml 磷酸盐缓冲溶液中，配制成浓度为5 g/L 的溶液，过滤灭菌，分装后避光保存在-20 ℃冰箱中，使用前用完全培养基稀释至1 g/L。

2.2 浸提液的制备

被检样品：对于1#～3#被检样品，浸提比例选择0.2 g/ml（无吸收性的固体器械），浸提条件为（37±1）℃、24 h；对于4#～16#被检样品，浸提比例选择0.1 g/ml（低密度材料），浸提条件为（37±1）℃、24 h[10]。

对照样品：阳性对照样品无需浸提，直接使用；阴性对照样品浸提比例选择0.2 g/ml，浸提条件为（37±1）℃、24 h[10]。

2.3 试验方法

将配制好的浓度为1×105/ml 的L-929细胞悬液每孔100 µl 接种于96孔培养板上，设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和被检样品组，每组至少各设6个复孔。第1次试验：每个被检样品（1#～16#）均分为浸提液组和1/2浸提液组。第2次试验：只选取1#、2#、3#、4#被检样品进行试验，将这4个被检样品的浸提液做梯度稀释，每个被检样品均分为1/2浸提液组、1/4浸提液组、1/8浸提液组和1/12浸提液组。

将96孔培养板置于二氧化碳培养箱（二氧化碳浓度为5%）中，37 ℃培养24 h，然后置于显微镜下观察，当细胞表现为约50%满度单层生长时，弃净原培养液，空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照样品浸提液，阳性对照组加入阳性对照样品浸提液，被检样品组加入相应稀释比例的浸提液，每孔100 µl，置于二氧化碳培养箱中，37 ℃继续培养24 h。

培养24 h 后，再次置于显微镜下观察细胞形态，弃净孔内培养液，每孔加入质量浓度为1 g/L 的MTT溶液50 µl，37 ℃继续培养2 h 后弃净孔内液体，加入100 µl 异丙醇，置于振荡器上振荡10 min，分别在酶标仪570 nm 和650 nm 波长下测定吸光度，计算相对增殖率（relative growth rate，RGR）：

式中，RGR 为相对增殖率（%），A 为被检样品组、阴性对照组及阳性对照组的吸光度，AB 为空白对照组的吸光度。

3 判定标准

细胞毒性分级按表2进行判定。

表2 细胞毒性分级

4 结果

本研究中细胞毒性试验采用的是GB/T 16886.5-2017中的MTT 法，结果显示，阴性对照样品及阳性对照样品的试验结果均符合要求，试验体系运行正常。依据被检样品细胞毒性情况，共进行两个阶段试验研究，两次试验结果如下。

4.1 被检样品第1次细胞毒性试验

由表3可知，1#～3#被检样品的RGR在2.2%～2.3%范围内，4#～15#被检样品的RGR 在3.7%～56.9%范围内，RGR 均＜70%；16#被检样品的RGR 为88.2%。

表3 第1次细胞毒性试验结果

4.2 被检样品第2次细胞毒性试验

为探讨有细胞毒性样品的毒性程度，选择1#～4#被检样品做进一步研究，将样品浸提液稀释2、4、8、12倍后进行试验，结果见表4。

表4 第2次细胞毒性试验结果

5 讨论

1#～3#被检样品的口罩带含有橡胶材质，浸提液细胞毒性相对较大；4#～15#被检样品的口罩带为氨纶加涤纶或氨纶加锦纶材质，浸提液均有一定的细胞毒性，但毒性小于1#～3#被检样品；16#被检样品的口罩带为非织造布材质，无细胞毒性。

根据材料组成选取被检样品1#、2#、3#及4#（4#作为4#～15#的代表）进一步探讨细胞毒性程度。第2次细胞毒性试验结果显示，2#被检样品稀释12倍后的浸提液的细胞RGR 仍然只有1.4%；对于其他3个被检样品，随着浸提液稀释倍数的增加，其表现出的细胞毒性均逐渐减小，其中，1#和4#被检样品稀释8倍后的浸提液的细胞RGR＞70%，3#被检样品稀释12倍后的浸提液细胞RGR＞70%。

医用口罩一般由主体材料（非织造布）和其他材料（金属铝片、弹性材料等）组成。标准的医用口罩一般采取将多层非织造布复合的形式，即由外部防水层、中间过滤层及内部吸湿层三部分构成[11-12]。非织造布材料普遍被用于制造口罩的主体部分，是公认的比较安全、无细胞毒性的材料，本研究也说明了其是一种细胞毒性试验合格的材料。现有研究资料表明，含有橡胶材质的医疗器械，如天然胶乳橡胶避孕套、含有硅橡胶的一次性使用导尿管、医用橡胶手套等，均具有不同程度的细胞毒性[13-14]，表明橡胶是一种有一定细胞毒性的材料。本研究结果也表明，含有橡胶材质的口罩带具有较大的细胞毒性，但多数产品稀释12倍后的浸提液的RGR＞70%，符合现行相关标准的要求，考虑到该类口罩产品已上市使用多年，未见由于口罩带细胞毒性引起不良反应的报告，因此，可适当放宽对这类产品口罩带细胞毒性的要求，如将按标准要求制备的浸提液稀释8～12倍后进行细胞毒性试验，若RGR ≥70%，则其细胞毒性可接受。总之，为了确保医用口罩使用安全，其相关标准宜对口罩带细胞毒性做出适宜要求。