一例华南虎淋巴瘤的诊断与分析

陈腾腾 傅文源，2 林锡潘 张 乐 兰作闽，4 童 鑫 林炜明 林艺群，6 林开雄*

(1.福建梅花山华南虎繁育研究所，上杭，364201；2.龙岩市地质公园保护发展中心，龙岩，364000；3.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；4.龙岩市野生动植物保护管理站，龙岩，364000；5.龙岩学院生命科学学院，龙岩，364012；6.江西农业大学动物科学技术学院，南昌，330045)

华南虎(Pantheratigrisamoyensis)又名中国虎，仅分布于中国，是最古老的虎亚种，国家一级保护野生动物[1]。自2001年以来，已没有可靠证据表明野外存在华南虎繁殖群体[2]。就现阶段而言，圈养在各动物园、繁育基地的约200只华南虎[3]，将是复壮种群的唯一希望。疾病作为困扰种群发展的重要因素，往往是造成动物死亡的直接原因[4-5]，淋巴瘤就是其中之一。淋巴瘤又称淋巴癌，一种原发于淋巴结和淋巴组织的恶性肿瘤，是一种慢性消耗性疾病。瘤细胞经淋巴血液途径扩散，形成大小不等的结节或致密肿块，可影响淋巴结及周围脏器。根据血象变化，淋巴瘤可分为“白血病性淋巴瘤”和“非白血病性淋巴瘤”两大类[6]。现在普遍认为，外源性因素和内源性因素是诱发淋巴瘤的致病原因[7]。在猫科(Felidae)动物肿瘤疾病中，淋巴瘤的发生较常见，约占猫科动物恶性肿瘤疾病的33%，并与猫科动物的白血病发生呈高度相关[8]。本研究将分析1例华南虎的淋巴瘤病例，针对该虎的发病实况和死后病理剖检情况进行探讨，旨在为华南虎的淋巴瘤诊断提供参考。

1 基本概况

患虎为成年雌性华南虎，来自福建梅花山华南虎繁育研究所，16岁，体型较瘦。其食物以鸡肉块、新鲜牛肉和新鲜野猪肉为主。参与首次繁殖前，有不定期的呕吐史，呕吐物为黏液及未消化的肉块。2016年开始繁殖后，基本无呕吐现象，2018年4月最后一次参与繁殖时，出现食幼崽情况。发病前采食量正常(4.0～5.5 kg/d)，与人亲近。

2 临床症状

2019年1月22日，华南虎日采食量下降，当日采食量仅为正常采食量的一半，但精神好，主动与人亲近，被毛光亮顺滑。自2月5日起，偶有进食，呈渐进性消瘦。鉴于此，在饲养管理上，饲养员调整了其食物结构，在投喂鸡骨架、小牛肉的基础上，增加新鲜牛肉和新鲜野猪肉。同时，将该虎放至散放区几日，增加其活动范围。之后1周内，该虎食欲差，甚至废绝，精神状态沉郁，舌苔苍白，基本不排便，尿液呈黄色。2月26—27日，出现双眼无神、喜卧、后肢轻微抖动等神经症状。兽医于2月28日对该虎进行麻醉取样，同时将其抬至保定笼中进行注射、输液治疗，在输液过程中该虎死亡。

3 常规检查及救治

对华南虎进行麻醉保定检查，发现其体表淋巴结显著肿大，口腔齿龈、巩膜等可视黏膜存在黄染。整个病情发展较为迅速。基于流行病学考虑，研究人员怀疑该虎存在血液原虫病感染，遂在其食物中添加血虫净药物进行驱虫，此时患虎偶有进食，精神尚佳。2周后，患虎呈渐进性消瘦，精神变差，舌苔苍白，尿液颜色加深，基本不排便，以饮水中添加抗生素进行保守治疗。随后的病程中，患虎呈现双眼无神、喜卧、后肢轻微抖动等症状。以4.0 mL陆眠灵、2.0 mL盐酸氯胺酮、1.0 mL硫酸阿托品及0.5 mL盐酸肾上腺素进行麻前给药与麻醉，并配合抗血液原虫治疗及补液支持疗法，行肌注5%三氮脒10.0 mL(1.0 g三氮脒溶于20.0 mL体积分数 0.9%的生理盐水)，10%右旋糖酐铁注射液(以Fe计50.0 mL：5.0 g)4.0 mL，尾静脉滴注250.0 mL葡萄糖氯化钠溶液及30.0 mL维生素C。整个病程持续1个多月，患虎于2019年2月底死亡。

4 剖检工作

4.1 体表检查

触摸虎体尚有余温，观察口腔、鼻孔、耳孔、肛周等天然孔腔无污染，体表无脱毛现象，无外伤痕迹，无体表寄生虫。可观察到眼睛、口腔可视黏膜及舌苔黄染(图1)。

图1 华南虎初步检查

4.2 皮下及腹腔检查

皮下脂肪、胸腹腔壁出现严重黄染(图2A、B)。胸腹腔中各脏器体位正常，膈膜完整，腹腔内有黄色积液，于四肢关节窝处发现黄色积液。

观察胸腹腔脏器，可见：①肝肿大，质脆。肝脏表面及实质内布满灰白色结节，其大小相近，触摸坚硬有颗粒感(图2C)。②脾肿大、质脆，切开可见布满大小不一的灰白色结节，一侧表面分布有白色点状突起，该突起大小相近，触摸较软(图2D)。③肺萎缩，表面散布灰白色结节，大小较为一致，质硬，部分肺叶表面散布黑点，肺叶边缘组织膨大呈空泡状(图2E)。④肾实质表面散布灰白色结节，触摸坚硬有颗粒感，其中肾盂有黄染(图2F)。⑤胰腺肿大，表面布满灰白色结节，其大小相近，触摸坚硬有颗粒感(图2G)。⑥胆囊外观正常，胆汁呈正常墨绿色。⑦膀胱黄染，无尿，膀胱内壁一侧散布有白色突起物，触摸软。⑧胃外观黄染，胃剖开无异常。⑨胸腔内心脏结构完整，心肌、心外膜无出血。

观察淋巴结，可见：在浅表淋巴结中(图2H)，双侧下颌9个淋巴结肿大似鸡蛋。两侧锁骨上7个淋巴结肿大如鸭蛋。两侧腋下10个淋巴结肿大坏死，大如鸭蛋。腹股沟淋巴结肿大。在深部淋巴结中，颈淋巴结肿大，肿大程度大小不一，并有部分坏死。肠系膜淋巴结肿大，形状不规则并有部分坏死。

图2 华南虎剖检结果

5 实验室诊断

5.1 固定液的配置

配置终浓度为2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液，简称双醛固定液[9]。具体配方如下：取10 g多聚甲醛溶于100 mL去离子水中，加热至65 ℃，期间逐滴加入1 mol/L NaOH溶液，缓慢摇动，待溶液澄清透明，冷却待用。PB溶液配置，A液，取7.8 g NaH2PO4·2H2O溶于去离子水中，定容至250 mL；B液，取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于去离子水中，定容至1 000 mL。取234.5 mL A液与1 000.0 mL B液混合均匀，即为PB溶液。取上述配置的多聚甲醛溶液100 mL，加入到250 mL的PB溶液中，再添加50 mL的25%戊二醛溶液，去离子水定容至500 mL，棕色瓶中保存，备用。采用双醛混合液的方式，可以更好地使醛分子渗入组织，加快蛋白变性凝固，以防止细胞死后发生自溶或被细胞分解，从而保持组织细胞原本的形态结构。

5.2 切片制作

切取各新鲜组织的病料块(厚度不宜超过1 cm)放入双醛固定液中，充分浸泡后，置于冰箱冷藏室(2～6 ℃)，24 h后即可制作切片。根据大量预试验摸索出组织块梯度脱水和浸蜡的最优时间(表1)。浸蜡后的组织块置于包埋机中进行包埋蜡块过程。切片时，切取5 μm薄片进行脱蜡、染色，染色时间需严格控制(表1)，以防背景颜色对最终结果产生干扰。染色后的切片以中性树脂封片。

表1 组织块的脱水、浸蜡和切片染色时间

5.3 光镜下观察

使用光学显微镜观察制作好的切片，结果显示：各组织切片中均可明显看到瘤细胞已经严重侵蚀内脏器官，并散布在这些内脏器官结构中。瘤细胞呈弥漫性排列，浸润并慢慢挤压周边的正常组织细胞。瘤细胞形态大小较为一致，呈圆形或卵圆形，体积小胞质少核大圆，染色呈深色。

肝脏(图3A)：肝实质被大量淋巴细胞样肿瘤细胞取代，形成包膜明显的肿瘤细胞区，肝脏细胞结构破坏，淋巴细胞浸润，肝索的结构紊乱。

脾脏(图3B)：局部多处散在脾脏实质细胞被淋巴细胞样肿瘤细胞取代，脾小梁萎缩，淋巴细胞浸润，白髓红髓间无明显界限。

肺脏(图3C)：支气管黏膜层纵行皱襞逐渐消失，淋巴瘤侵入管腔，透明软骨细胞大量坏死。肺小叶局部存在结缔组织增生，肺泡隔细胞成分增多，出现大量成纤维细胞，肺泡隔增厚，并伴随淋巴细胞浸润。

肾脏(图3D)：肾实质被淋巴细胞样肿瘤细胞取代，肿瘤区肾小管等结构全部消失，零星存在的肾小球被淋巴细胞浸润。其余未被肿瘤细胞取代的肾实质处，发生肾小管上皮细胞坏死、核溶解、消失，局部可见形成的管形；肾小球结构紊乱、萎缩，甚至消失。

胰腺(图3E)：实质细胞被淋巴细胞样肿瘤细胞取代。

淋巴结(图3F)：被许多滤泡样结构占据，这些结构由中型至大型淋巴细胞组成。这些细胞包浆稀少，细胞核圆形，染色体呈细点状，常见明显的核仁。偶见有丝分裂相。

图3 华南虎组织病理变化

6 结果

剖检结果显示，患虎全身淋巴结均肿大坏死，肝、脾、肾、胰、肺等脏器表面均有灰白色结节。肝损伤导致机体出现严重的黄疸，致使全身明显黄染。肾脏异常，使得患虎在排尿及尿液颜色方面出现问题，加之饮水少使得尿色出现浓茶色样。肺脏萎缩，边缘组织膨大如空泡状，致使机体气体交换氧合作用降低。各脏器组织功能的损伤，引起机体运转异常，使患虎出现精神不振、不愿运动、喜卧等症状。仅从剖检结果看，患虎是因机体大部分器官受到不同程度的损坏，打破机体稳态平衡，最终致死。

组织病理学检测结果显示，患虎各脏器都有不同程度的损坏。从切片镜检中均可发现淋巴细胞样瘤细胞浸润于各脏器组织内。在淋巴结中，正常淋巴结结构被大片形态一致的淋巴细胞样肿瘤细胞取代，且多个器官被累及。通过观察，研究人员还发现脏器中的肿瘤细胞与淋巴结中肿瘤细胞形态一致。瘤细胞主要以分裂细胞为主，呈淋巴样细胞，其细胞组织形态符合细胞性恶性淋巴瘤。根据剖检记录和病理组织切片的观察，最终判定为体表、肠系膜淋巴结B细胞恶性淋巴瘤，累及肝脾、肺、肾脏、胰腺等组织。由于这些器官组织的正常结构遭到破坏，严重影响着机体的正常运作和健康，最终导致机体死亡。

7 讨论

肿瘤是虎(Pantheratigris)的多发性疾病[10]。据报道，动物园中圈养虎的肿瘤发病率高达33%，患肿瘤个体占死亡个体的69%[11]。此外，张向鹏[12]调查并统计了贵州地区3种野生动物的常见疾病，结果显示华南虎的疾病发生率占总体发病率的44%。

虎为国家一级保护动物，属大型猛兽，治疗中不像临床体型较小的动物易控制、好接触，在疾病诊断方面尤为困难。短暂全麻诊断疗法的麻醉风险要远高于肿瘤风险。所以，一般情况下均采取保守治疗，在食物或饮水中添加抗生素。本案例中，患虎出现食欲废绝、精神差、喜卧而不愿运动时，考虑病情已危及生命，行全麻后扎留置针以静脉输液进行治疗。仅根据一般临床症状，还不足以用来确诊病因，但如果出现持续性食欲减弱、体型消瘦、浅表淋巴结肿大等，可考虑进一步抽血化验，从而有针对性地、全面地制定诊疗方案。若在癌症早期确诊，还可考虑进行药物或手术切除以控制和缓解病情。

病理诊断是诊断肿瘤的“金标准”[13]。本研究中，患虎发病可能由多方面原因所致。由于所内未发现其他虎出现异常情况和临床特征，基本排除了所内存在传染性疾病因素，怀疑发病原因与患虎本身机体情况、营养状态及免疫缺陷等有关。患虎发病前有呕吐史，可能已显示机体免疫力低下。初步怀疑其消化道已有一定的疾病，淋巴瘤的发生与其呕吐既往病史是否有关，还有待进一步研究。