基于ISSR标记的贵州山核桃遗传多样性分析

郭计华， 程 敏， 苗贵东， 夏可灿， 张 培， 张万芹， 蔺维成， 王颖娟

(兴义民族师范学院， 贵州 兴义 562400)

山核桃(CaryacathayensisSarg)，又名小胡桃(小核桃)、山蟹、野漆树等[1-2]。根据植物学分类，山核桃属于胡桃科山核桃属，与核桃(Juglansregia)不同属。山核桃是落叶乔木树皮平滑，树高10～20 m。山核桃果肉中富含多种氨基酸，含有7种人体必需氨基酸[3-5]。此外，山核桃还富含对人体有益的多种矿质元素[6]、维生素等营养物质，山核桃的种仁、外果皮及根皮皆可入药，是公认的营养价值极高的坚果，越来越受人们的青睐。

贵州山核桃(Caryakweichowensis)为山核桃品种中的一大类，主要分布在贵州省黔西南州安龙县、册亨县及望谟县等地，通常生长在海拔500～1 300 m的山坡林中，喜光润和湿润的环境，是我国的特有品种之一。但贵州山核桃的分布区域狭窄，很难自然生长和更新。由于野生山核桃资源稀缺，种质资源濒临灭绝。因此，对贵州山核桃进行遗传学研究，有效开展贵州山核桃遗传保护和杂交育种研究具有重要意义。

邓朝义[7]首次发表了贵州山核桃的相关报道。尽管贵州山核桃是一种优质种质资源，长期以来，缺乏开发利用和保护，本实验通过分子标记辅助育种技术对贵州山核桃遗传多样性进行研究。

ISSR分子标记技术已逐渐运用于山核桃遗传育种的研究中。焦思宇等[16]以33份薄壳山核桃为研究材料，利用ISSR分子标记对其品种种质资源进行遗传多样性分析，从而为后期山核桃遗传育种和保护打下良好基础。而基于ISSR分子标记的贵州山核桃遗传多样性分析目前未见相关报道，可见其在分子水平仍显滞后，因而限制了贵州山核桃的遗传应用。因此基于猕猴桃[17]、中国芋[18]、小麦[19]等大多数植物分子标记开发的基础上，本研究以贵州山核桃为材料，采用ISSR分子标记对黔西南州贵州山核桃遗传多样性进行评价研究，从而进一步对贵州山核桃种质资源进行分析。以期在较短时间内培育出优良的贵州山核桃品种，为开展资源利用和保护提供分子遗传学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料均采自贵州省黔西南州安龙县栖凤镇山核桃嫩叶(无病虫害)样本，选取24份贵州山核桃样品。

1.2 实验方法

1.2.1贵州山核桃基因组DNA提取

将山核桃的嫩叶放置保鲜袋中，做好标记，保存在低温冰柜中备用。用植物基因组DNA试剂盒提取贵州山核桃基因组DNA(提取方法见试剂盒说明书)，根据琼脂糖凝胶电泳效果图，筛选出24个条带清晰、质量达标的DNA，用于后续群体遗传分析。将提取的DNA放在-20 ℃的冰柜中，以备后续实验研究，并防止DNA降解。

1.2.2引物合成与筛选

择优选取20条ISSR引物并进行引物合成(由深圳华大基因科技有限公司合成)。使用贵州山核桃DNA编号1～5为模板，选用20.0 μL的PCR反应体系进行引物筛选，PCR反应步程序表1所示，PCR反应体系如表2所示。

表1 PCR反应程序

表2 20.0 μL PCR反应体系

1.2.3数据统计、分析

采用DL 2000作为DNA的相对分子量标准，根据凝胶上PCR扩增产物的相应位置，根据电泳带谱扩增的有无而记录下来，有带记作“1”，无带记作“0”，模糊不清的扩增条带默认为缺失，从而得到ISSR基因型数据矩阵(由“1”和“0”组成)。运用Popgene.32软件分析贵州山核桃的遗传特性，以计算出PPB、Nei基因多样性指数、Shannon信息多样性指数。24份贵州山核桃的遗传相似系数利用NTSYS 2.1软件计算，并采用UPGMA法对实验所得的数据进行遗传相似性聚类分析[20]。

2 结果与结论

2.1 贵州山核桃DNA检测

选取24个质量较好的DNA为模板，用于后续群体验证。其DNA质量高低的判断依据是DNA经过琼脂糖凝胶电泳后，通过Gel Doc XR+凝胶成像分析系统效果图分析所得，其部分DNA电泳检测结果见图1。

注：M为D 2 000 bp Marker。

2.2 ISSR引物筛选

本次实验中20条目标引物经过筛选，为获得可群体分析的引物，经过反复筛选分析，最终筛选出5条引物(UBC 841、UBC 842、UBC 844、UBC 845和UBC856)，其条带清晰明亮、稳定性好，可用于后续PCR扩增，而其余的引物无法扩增出条带或所扩出的条带不够清晰明亮。ISSR引物序列及最佳退火温度见表1，部分引物筛选结果见图2。

注：M为D 2 000 bp Marker，1～18分别引物编号。

图2中有些引物条带模糊，不够清晰，原因可能是同批次退火温度无法达到目标引物的最佳退火温度；在后续实验中，通过多次PCR反应体系优化可避免上述现象。

2.3 ISSR标记群体检测

将筛选出的5条ISSR引物分别进行PCR扩增实验(模板为24个贵州山核桃DNA)，经脂糖电泳后，清晰可重复的DNA片段共检测到30条，有30个位点，其中多态性位点有26个，PPB为86.67%(见表3)。运用Popgene 32软件分析24份贵州山核桃的遗传多样性(表4)。引物UBC 845、UBC 856的贵州山核桃扩增电泳图谱分别如图3、图4所示。

注：M为D 2 000 bp Marker，1～24为种质序号。下同。

图4 引物UBC 856的贵州山核桃扩增图谱

表4 贵州山核桃遗传多样性

2.4 聚类分析

根据5条ISSR引物扩增结果的数据统计，对24份贵州山核桃的遗传距离进行计算(利用NTSYS 2.1软件)，并对24个个体进行聚类分析(图5)。

由图5可以看出，当遗传相似系数为0.712时，24个个体可聚为四个类群：第一类群包括材料1、2、8、9、11、13、14、15、16、19、20、21；第二类群包括材料3、4、5、7、10、17、18、22、23、24；材料6归为第三类群，材料12归为第四类群。结果显示，24份贵州山核桃的遗传差异较大，说明材料6和材料12与其他22个种质间遗传关系较远，其余22份种质间遗传距离较小，遗传相似度较高，遗传关系较接近，群体具有较高的遗传多样性。

图5 24份贵州山核桃种质的聚类分析

3 讨 论

ISSR分子标记技术已广泛应用于各类植物种群的遗传多样性分析[21]，例如ISSR分子标记技术已应用于猕猴桃[17]、中国芋[18]、小麦[19]、野生菰[22]、杉木[23]、樱桃[24]、大菊[25]等植物中，从这些研究中可以看出，ISSR分子标记在植物中的应用很广泛。与其他分子标记相比，ISSR分子标记具有模板DNA的使用量少，操作简便，多态性高，成本低，无需测序和引物设计，安全性高，更快，更方便，稳定性强及适用性广泛等优点[8]。核桃品种丰富多样，但就目前研究来看，专门对核桃种质资源的鉴定研究甚少，仅李国田等[26]利用ISSR对16个北方核桃品种进行了分析研究，建立了16个核桃品种的指纹图谱，其研究的核桃品种主要是适于北方生长，本研究所用核桃品种为南方核桃主栽品种。本研究首次利用ISSR分子标记技术对贵州山核桃遗传多样性进行分析，首先利用筛选出的5条ISSR引物进行群体扩增，获得了30条高质量条带，其中26条有多态性，PPB达86.67%(表3)。其中引物UBC 841和UBC 842多态性最高，皆达100%，引物UBC 844和引物UBC 845多态性最低，皆为66.7%。从研究结果可以看出，ISSR分子标记是一种经济高效的技术方法，具有良好的重复性和多态性，可用于后续的贵州山核桃间遗传多样性研究，为开展贵州山核桃种质资源利用和保护提供分子生物学依据。

表3 5条ISSR引物序列及扩增效果

贵州山核桃在育种实践中的应用方向由其遗传多样性的高低所决定。运用Popgene 32软件计算其遗传多样性，研究结果数据显示，PPB达86.67%，He为0.334 4，Ne为1.579 8，I为0.491 6，从PPB、He、I可以看出，贵州山核桃种质资源确实存在较为丰富的遗传多样性，可用于后续品种间遗传距离的分析。目前贵州山核桃在贵州的分布范围以兴义、册亨、望谟、安龙等县较为集中。研究结果表明，利用ISSR分子标记研究贵州山核桃的遗传多样性是可行的，种群多样性为开展物种群组选育和远缘杂交选育提供重要的遗传学研究基础，为贵州山核桃种质资源的鉴定和分类提供重要的研究工具和技术参考。