肺血管炎外周血miRNA表达水平及其临床意义

刘贤，陈强伦，冯胜东

（1.河南省信阳市中医院肺病科，河南 信阳 464000；2.河南省郑州市第七人民医院心内科，河南 郑州 450000）

肺血管炎是全身性、系统性坏死性血管炎累及肺脏血管的一组疾病，在我国并不少见，多发于中老年人群[1]。肺血管炎属于风湿免疫类疾患，具有起病隐匿，多脏器受累的特点，临床表现复杂多样、缺乏特异性，主要表现为肺部炎性反应和伴有不同程度肺外脏器损害，肺科医生若不熟悉此病特点极易引起误诊和漏诊，影响肺血管炎的治疗和预后[2]。因此，早期诊断与鉴别肺血管炎就显得尤为重要。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是机体代谢分子群中新近发现的生物活性RNA分子，存在于人类外周血中，能够与血浆中多种分子相结合，通过多种分泌方式参与呼吸系统疾病、神经障碍、自身免疫性疾病等多个系统疾病的发生和发展过程[3]。miRNA在不同疾病人群的血浆表达水平不同，并且能在血清和血浆中持续且稳定的表达，故可作为疾病的生物学标志物[4]。目前对于miRNA在肺血管炎中表达的相关研究鲜有文献报道，因此，本研究分析了肺血管炎患者外周血中miRNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a的表达水平及其临床意义，以期为临床肺血管炎的诊断提供一些理论参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年3月至2019年3月期间我院收治住院的86例抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性肺血管炎患者作为研究对象，纳入研究组，对其临床资料和组织血清标本进行回顾性分析。86例患者中男性52例，女性34例；年龄29～75岁，平均年龄（51.46±5.23）岁；病程（2.59±0.35）年；其中显微镜下多血管炎（MPA）79例，肉芽肿性血管炎（GPA）7例。纳入标准：（1）所有患者符合ANCA相关性肺血管炎的诊断标准[5]，以及其中MPA和GPA的分类标准，并经电子计算机断层扫描（Computed tomography,CT）、肺活检确诊为肺血管炎；（2）均以发热、咳嗽、咳痰、咳血、胸痛和不同程度呼吸困难为主要表现者；（3）ANCA检测为阳性者；（4）具备血清标本和完整的临床资料者。排除标准：（1）发病前已确诊有上呼吸道感染或肺部感染或其他肺部疾病患者；（2）合并恶性肿瘤、严重心脑血管疾病者。另选取于我院行健康体检的人群80例作为正常对照组，均具备血清标本和完整的临床资料者。排除标准：（1）合并严重肝肾功能障碍、恶性肿瘤者；（2）全身免疫性疾病者；（3）严重心脑血管疾病者。对照组中男性39例，女性41例，年龄27～76岁，平均年龄（52.26±5.77）岁，两组性别、年龄比较无明显差异（P＞0.05），具有可比性。本研究在获得医院伦理委员会审核批准后进行。所有患者血清标本均取自患者的外周血，并经10 000 r/min高速离心后取上清液置于液氮中保存。

1.2 实验室指标检测 统计患者入院时血清检查指标，包括血清C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、红细胞沉降率（Erythrocyte sedimentation rata,ESR）、肌酐值和血常规指标等。其中CRP采用酶联免疫法进行检测，ESR采用魏氏法自动血沉测定仪测定，肌酐值和血常规采用日立7100型全自动生化分析仪进行检测。

1.3 miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a的检测 采用实时定量-PCR方法进行miRNA的检测，主要操作方法为：取两组患者冻存的血清标本，采用RNeasy Mini Kit总RNA提取试剂盒按规定步骤提取血清中游离总RNA，即刻逆转录成cDNA用于扩增。选RUN6为内参照，其中miRNA-155引物序列：5” -CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3” 。mi RNA-125b引物序列上游：5” -ACACTCCAGCTG GGTTAATGCTAATTGTGAT-3” ，下 游：5” -TGGTGTCGTGGAGTCG-3” 。mi RNA-125b：PCR引物序列 上 游：5” -UCCCUGAGACCCUAPCUUGUGA-3” ，下 游：5” -ACAPGUUAGGGUCUCAGGGAUU-3” 。mi RNA-146a：正相引物序列为：ACACTCCAGCTG GGT-GAGAACTGAATTCCATGGGT，反相引物序列为：CT-CAACTGGTGTCGTGGA。经过35个循环扩增后，根据Ct值分析出miRNA相对表达量，绘制熔解曲线，根据熔解曲线判断PCR产物的特异度。使用2-ΔΔCT法计算各组miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对实验数据进行分析，本研究中涉及的计数资料用%表示，采用χ2检验；计量资料采用“Mean±SD”表示，两组间比较采用两样本t检验，多因素分析采用Logistic回归模型；通过ROC曲线分析mi RNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a对肺血管炎的诊断价值；对符合正态分布的两数据采用Pearson进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中mi RNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a表达水平比较 经半定量RT-PCR检测后，研究组血清miRNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a表达量明显高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血清中miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a表达水平比较

2.2 发生肺血管炎的单因素分析 两组患者有无进行性贫血、肌酐值、服用PTU药物史比较无显著性差异（P＞0.05），两组患者在年龄、肺部感染史、CRP、ESR、mi RNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a方面存在明显差异（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者肺血管炎的单因素分析

2.3 两组患者肺血管炎的多因素Logisitic回归分析 以是否发生肺血管炎作为因变量，将单因素中差异存在统计学意义的因素（年龄、CRP值、ESR值、肺部感染史、血清mi RNA-155表达、血清miRNA-125b表达、血清miRNA-146a表达）作为自变量，并进行赋值，年龄（<50岁=0，≥50岁=1）肺部感染史（无=0，有=1）、血清CRP值（<10 mg/L=0，≥10 mg/L=1）、ESR（<27 mm/1h=0，≥27 mm/1h=1）、血清mi RNA-155表达（<0.7=0，≥0.7=1）、血清mi RNA-125b表达（<2=0，≥2=1）、血清miRNA-146a表达（<1=0，≥1=1），并将其纳入Logisitic回归模型中，结果显示血清miRNA-155表达≥0.7、血清miRNA-125b表达≥2和血清miRNA-146a表达≥1是患者发生肺血管炎的独立预测因素，见表3。

表3 影响肺血管炎的多因素Logisitic回归分析

2.4 单项指标诊断与联合诊断的ROC曲线分析ROC曲线显示血清中miRNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a表达水平单独诊断肺血管炎的ROC曲线下面积分别为0.735、0.681和0.740，联合诊断肺血管炎的ROC曲线下面积为0.867。血清中miRNA-155、miRNA-125b和mi RNA-146a表达水平联合诊断肺血管炎的ROC曲线下面积显著高于miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a的单项诊断，差异性显著（P＜0.05）；且血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a水平单独诊断肺血管炎时，三个指标的截断值分别为：0.736、2.256和1.148，见表4，图1。

图1 血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a单项诊断与联合诊断ROC曲线

表4 各种检测方法的ROC曲线AUC值

2.5 血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a水平的相关性分析 将血清miRNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a数据进行Pearson相关性分析，得出miRNA-155与miRNA-125b的两数据呈显著正相关性（r=0.246，P=0.013）；miRNA-125b与mi RNA-146a的两数据呈显著正相关性（r=0.316，P=0.025）；miRNA-155与miRNA-146a的两数据呈显著正相关性（r=0.31，P=0.014）。

3 讨论

肺血管炎是系统性小血管炎侵润肺部最常见疾病，部分患者继发于肺部感染或肺以外的慢性肾炎、风湿性关节炎等病，常累及肾脏导致肾功能异常，但在早期时症状不明显，后期症状表现亦不典型，导致早期诊断较为困难[6-7]。肺血管炎患者早期实验室指标检查常出现ASR明显增加、CRP升高，但无特异性，特异性指标抗中性粒细胞胞浆抗体检测在早期也可能呈阴性表达，其阴性率可达30%，极易导致患者被误诊和漏诊[8]。因而，积极寻求更为有效且准确的肺血管炎检测指标对于其早期诊断、治疗和预后具有重要的临床意义。已有研究表明miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a等miRNA分子能参与机体免疫、内分泌及神经系统的调节，并且在血浆中呈持续、稳定的表达，可作为多种疾病的生物学标志物[9]。

本研究通过半定量RT-PCR法检测得出研究组血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a 表达量明显高于对照组，肺血管炎的单因素分析结果显示，两组患者在年龄、肺部感染史、CRP、ESR、miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a方面存在明显差异；多因素分析结果显示，血清mi RNA-155表达≥0.7、血清miRNA-125b表达≥2和血清mi RNA-146a表达≥1是诊断患者发生肺血管炎的独立预测因素。以上结果表明，miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a在肺血管炎患者血清中呈高表达，并且三者在血清中的高表达与肺血管炎发生的具有重要联系。肺血管炎患者既往出现肺部感染可能造成机体免疫功能下降，肺部血管易遭受病原菌感染而引发血管炎症反应，肺部出现感染患者若不及时治疗，病情严重时极可能引发肺血管炎，并出现与之类似的发热、咳嗽、呼吸困难等症状[10]。同时，当患者机体出现CRP≥10 mg/L、ESR≥27 mm/1 h时，常提示患者的炎症急性相反应，此时结合患者早期呼吸道症状，可初步认为患者有发生肺血管炎的可能。CRP和ESR均是目前临床上的常用炎症指标。对于mi RNA分子参与肺血管炎的反应机制，有研究表明，肺血管炎的本质是多种炎症细胞参与调节的血管炎症反应，其炎症反应细胞包括中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸细胞、单核细胞、巨噬细胞等多种成分混合出现[11]。这些炎症反应细胞能分泌多种具有组织损伤性的蛋白颗粒，引起炎症反应，是反映全身免疫状态的重要监测指标，其在肺部血管的聚集和浸润还可进一步导致血管结构发生改变[12]。mi RNA-155是被证实对T细胞功能相关的基因表达和炎症反应发挥重要的调节作用的miRNA分子，参与T细胞、B细胞和巨噬细胞的发育、分化、活化、增殖及其稳态的维持，其在肺血管炎患者血清中呈现高表达其机制目前尚不明确，考虑与mi RNA-155参与淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞的形成有关[13]。miRNA-125b在肺血管炎患者血清中的高表达考虑与其抑制了抑癌基因P53的表达有关[14]。人体抑癌基因p53参与了嗜酸性粒细胞的凋亡过程，而MiRNA-125b被证实可抑制p53mRNA的表达并对其进行负向调控抑制细胞凋亡的发生。MiRNA-125b高表达时通过抑制p53基因的表达减少了嗜酸性粒细胞的凋亡，促进了患者的肺部血管炎症反应[15]。实验证明，miRNA-146a的表达受核因子kB直接调控，同时可以mi RNA-146a标靶白介素1受体下游的信号因子[16]。肺血管炎患者机体较强的炎症反应，使免疫细胞中核因子kB的活性增强，进而调控mi RNA-146a在血清中呈现高表达水平[17]。因此，血清中mi RNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a三种分子的表达量与肺血管炎的发生均呈现正相关关系，这与本研究的相关性分析结果一致。

本研究结果显示，血清miRNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a表达水平联合诊断肺血管炎的ROC曲线下面积显著高于三者单独诊断时的ROC曲线下面积，表明血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a表达水平联合检测肺血管炎的价值更高，可作为肺血管炎诊断的新指标，具有较好的应用价值。然而本研究仍有局限性，本研究为回顾性分析，且年龄亚组分析两组不匹配，故难免存在偏倚；另外本研究为单中心研究，样本量较少，因此未来尚需扩大样本量，开展多中心研究。

综上所述，mi RNA-155、mi RNA-125b和miRNA-146a在肺血管炎血清中呈高表达，并互为正相关性，血清三项指标联合检测对于临床上预测与诊断肺血管炎具有较好的应用价值。因而临床上可通过联合检测患者血清miRNA-155、miRNA-125b和miRNA-146a水平以筛选肺血管炎的高风险人群，并进行预测和诊断肺血管炎的发生，尽早采取治疗措施，防止病情恶化。